高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用

本申请为申请号2020101696453发明专利的分案申请，原申请的申请日为2020年03年12日，发明创造名称为一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用。本发明涉及环境微生物，特别是涉及高产1,3-丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用。

背景技术：

1、1,3-丙二醇是一种重要的大宗化学品，在化妆品、食品、润滑剂和医药等行业均有广泛应用，尤其作为单体与对苯二甲酸聚合形成聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt)。ptt具有良好的性能，在服装行业、地毯行业、工程热塑料行业被大量应用，从而带动1,3-丙二醇的市场需求量。

2、生物法合成1,3-丙二醇的技术主要集中在两个方向，其中一个是葡萄糖为底物，另一个为甘油为底物。在代谢甘油合成1,3-丙二醇的系列微生物中，克雷伯氏菌(包括克雷伯氏肺炎杆菌(klebsiella pneumoniae)和克雷伯氏产酸杆菌(klebsiella oxytoca))是一类兼性厌氧菌、具有发酵操作简单、1,3-丙二醇的合成量和转化率较高等的优势，因此，克雷伯氏菌是一类最有前景应用于工业化生产1,3-丙二醇的菌株。

3、克雷伯氏菌代谢甘油合成1,3-丙二醇的途径包括氧化支路和还原支路。在氧化支路，甘油经甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶的催化生成磷酸二羟基丙酮，之后进入糖酵解途径，生成乙醇、乳酸、琥珀酸、乙酸、2,3-丁二醇等副产物。副产物的生成降低了底物的转化率，同时不利后续工艺1,3-丙二醇产品的提取。在还原支路，甘油在甘油脱水酶(dhab)的作用下合成3-羟基丙醛，然后由1,3-丙二醇氧化还原酶催化生成1,3-丙二醇。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌及其构建方法及应用，用于解决现有技术中的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种克雷伯氏工程菌，为二醇脱水酶相关基因被敲除的克雷伯氏工程菌。

3、优选的，所述二醇脱水酶相关基因选自二醇脱水酶基因和/或二醇脱水酶活化因子基因。

4、更优选的，所述二醇脱水酶基因选自pduc、pdud、pdue中的一个或多个基因；所述二醇脱水酶活化因子基因选自pdug、pduh中的一个或多个基因。

5、优选的，所述克雷伯氏工程菌中乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因亦被敲除。

6、更优选的，所述乳酸脱氢酶基因为ldha基因。

7、更优选的，所述乙醇脱氢酶基因为adhe基因。

8、所述克雷伯氏工程菌k.pδpduδldhδadh发酵30小时1,3-丙二醇的产量、转化率均较未改造的克雷伯氏菌分别提高了25.8％，10.3％；k.oδpduδldhδadh发酵30小时1,3-丙二醇的产量、转化率均较未改造的克雷伯氏菌分别提高了22.11％，7.97％。

9、本发明第二方面提供一种构建克雷伯氏工程菌的方法，所述方法包括以下步骤：将二醇脱水酶相关基因敲除。

10、优选的，所述二醇脱水酶相关基因敲除选自二醇脱水酶基因和/或二醇脱水酶活化因子基因。

11、优选的，所述方法还包括敲除乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因。

12、本发明第三方面提供一种克雷伯氏工程菌在发酵生产1,3-丙二醇方面的应用。

13、本发明的克雷伯氏工程菌生产1,3-丙二醇的方法包括如下步骤：

14、1)将克雷伯氏菌株接种到种子培养基中扩大培养；

15、2)将步骤1)的克雷伯氏工程菌接种到发酵培养基发酵。

16、进一步的，所述发酵培养基为含甘油的发酵培养基，

17、更进一步的，所述发酵培养基中甘油的初始浓度为20-50g/l。

18、进一步的，发酵过程中甘油浓度控制在10-30g/l。

19、进一步的，发酵过程中ph值控制在6.5-7.5。

20、进一步的，发酵温度控制在30-40℃。

21、进一步的，发酵过程中进行搅拌，搅拌速度控制在100-300rpm。

22、进一步的，发酵过程中向发酵罐中通气，通气量控制在1-4l/min。

23、更进一步的，通入的气体为空气。

24、如上所述，本发明的提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌的构建方法及应用，具有以下有益效果：构建的工程菌遗传性能稳定，合成1,3-丙二醇的产量、转化率明显提高，副产物乳酸和乙醇的生成量减少，是一株比较有应用前景的工程菌。本发明提供的克雷伯氏工程菌的构建方法比较有应用价值。

技术特征：

1.一种克雷伯氏工程菌，其特征在于，所述克雷伯氏工程菌为二醇脱水酶相关基因被敲除的克雷伯氏工程菌，所述二醇脱水酶相关基因为二醇脱水酶活化因子基因。

2.根据权利要求1所述的克雷伯氏工程菌，其特征在于，所述二醇脱水酶活化因子基因选自pdug、pduh中的一个或多个基因。

3.根据权利要求1所述的克雷伯氏工程菌，其特征在于，所述克雷伯氏工程菌中，乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因亦被敲除。

4.根据权利要求3所述的克雷伯氏工程菌，其特征在于，所述乳酸脱氢酶基因为ldha基因，和/或，所述乙醇脱氢酶基因为adhe基因。

5.一种构建克雷伯氏工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将野生型克雷伯氏菌的二醇脱水酶相关基因敲除，所述二醇脱水酶相关基因为二醇脱水酶活化因子基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述二醇脱水酶活化因子基因选自pdug、pduh中的一个或多个基因。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括敲除乳酸脱氢酶基因和/或乙醇脱氢酶基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳酸脱氢酶基因为ldha基因；和/或，所述乙醇脱氢酶基因为adhe基因。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用同源重组的方法敲除基因。

10.如权利要求1-4任一所述克雷伯氏工程菌在生产1,3-丙二醇的应用。

技术总结
本发明属于环境微生物技术领域，特别是涉及高产1,3‑丙二醇的克雷伯氏工程菌构建方法及应用。本发明利用生物技术失活克雷伯氏菌二醇脱水酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等酶的活性。构建的工程菌进行1,3‑丙二醇发酵时，1,3‑丙二醇的产量和转化率提高，副产物乳酸和乙醇的生成量减少。本发明提供的方法构建的工程菌遗传性能稳定，1,3‑丙二醇合成性能良好，副产物产量减少，是一项比较有应用价值的克雷伯氏工程菌构建方法。

技术研发人员：魏东
受保护的技术使用者：中国科学院上海高等研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12