检测新冠病毒Gamma变异株的qRT-PCR方法与流程

本发明属于试剂盒，具体涉及检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr方法。

背景技术：

1、新型冠状病毒(sars-cov-2)可引起人新型冠状病毒性肺炎，以发热、乏力、干咳为主要表现，约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。sars-cov-2的准确高效检测是目前丞待解决的问题。

2、分子生物学检测是针对新冠病毒感染机体后所复制产生的病毒rna进行检测，由于免疫系统产生的igm、igg抗体时间比较晚，而复制产生的病毒rna能更早被检测出来，因此当前新冠病毒最主要的诊断方法是病毒核酸检测，主要包括全基因组测序、实时荧光定量pcr(rt-pcr)、crispr、逆转录环介导等温扩增技术(rt-lamp)等，其中实时荧光定量pcr方法(rt-pcr)仍是检测新型冠状病毒的金标准。

3、sars-cov-2是单链rna病毒，该病毒基因组约由29903个核苷酸构成，编码4种结构蛋白：核蛋白(n)、包膜(e)、基质蛋白(m)、刺突蛋白(s)，以及rna依赖性rna聚合酶(rdrp)。其中s蛋白是重要的结构蛋白，其主要功能是通过受体结合结构域rbd、n端结构域ntd促进病毒包膜与宿主细胞的ace2结合，使宿主细胞和病毒融合。目前指定的vocs有alpha、beta、gamma、delta、omicron变异株；vois有lambda和mu。容易发生突变是多数rna病毒的一种固有性质，rna病毒的核酸序列的改变会影响现有的核酸检测的准确性；针对新冠病毒变异性强的特点，开发能够快速检测变异型的新冠病毒检测方法是十分必要的。

4、尤其是新冠病毒gamma变异株(又称p.1分支)，于2021年1月在巴西首先被发现，病毒spike蛋白在k417t、e484k和n501y位点发生变异，和原型株、alpha变异株和beta变异株相比，病毒具有更高的传播力和中和抗体拮抗能力，有可能拮抗疫苗的保护作用。

5、因此亟需一种新冠病毒gamma变异株的快速检测方法。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明提供了引物探针组合用于检测新冠病毒gamma变异株，还将引物探针组合制备为检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr试剂盒，实现新冠病毒gamma变异株进行快速地鉴定。

2、具体的，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了新型冠状病毒s基因的k417t、e484k和n501y序列作为标志物在制备检测试剂或检测试剂盒中的应用。

4、第二方面，本发明提供了新型冠状病毒s基因的k417t、e484k和n501y序列作为标志物在制备区分新冠变异株gamma和普通新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。

5、第三方面，本发明还提供了引物探针组合，包括：

6、(a)引物，具有如seq id no.1～8所示的核苷酸序列；

7、(b)荧光探针，具有如seq id no.9～12所示的核苷酸序列；所述荧光探针5’端均标记荧光基团，3’端均标记猝灭基团；所述5’端荧光基团为fam、vic、rox、cy3和cy5中的一种或多种，所述3’端猝灭基团为eclipse、bhq1,、bhq2和mgb中的一种或多种。

8、使用上述新冠病毒gamma变异株的引物、荧光探针对新冠病毒gamma变异株进行检测；

9、(c)如(a)或(b)引物或探针的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(a)或(b)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

10、(d)与(a)、(b)或(d)引物或荧光探针的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

11、使用上述的引物、荧光探针对新冠病毒gamma变异株进行检测；所述新冠病毒gamma变异株为spike蛋白在k417t、e484k和n501y位点发生变异的新型冠状病毒。

12、进一步的，seq id no.1～seq id no.8所示的引物在pcr反应体系中的终浓度为3～5pmol/μl，seq id no.9～seq id no.12所示的探针在pcr反应体系中的终浓度为0.5～0.8pmol/μl。

13、第三方面，本发明还提供了所述引物探针组合在制备新冠病毒检测的试剂或试剂盒中的应用；所述新冠病毒包括新冠病毒gamma变异株。

14、第四方面，本发明还提供一种检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括pcr反应液1和pcr反应液2；所述pcr反应液1包含无rna酶水、反转录酶、dna聚合酶、ung酶、dntps、甘油、hepes、tris-hcl缓冲液、mgso4和seq id no.9～seqid no.12所示的探针；所述pcr反应液2包含无rna酶水、mgcl2、叠氮化钠和seq id no.1～seq id no.8所示的引物。

15、进一步的，所述dna聚合酶的终浓度为4～6u，ung酶的终浓度为0.06～0.12u，dntps的终浓度为0.65～0.15mmol/l，tris-hcl缓冲液的浓度为50～55mmol/l，mgso4的终浓度为2～8mmol/l，甘油的浓度为10％～20％(质量)，hepes的浓度为15％～20％(质量)、mgcl2的终浓度为15-30mmol/l、叠氮化钠的浓度为0.05％-0.1％(质量)。

16、第五方面，本发明还提供了本发明还提供了新冠病毒gamma变异株的检测方法，取待测样本与本发明所述的引物探针组合或所述的试剂盒中的引物探针组合混合后扩增，检测。

17、本发明的有益效果在于：

18、本发明提供了检测新冠变异株gamma的引物、探针和试剂盒，通过新型冠状病毒s基因的k417t、e484k和n501y序列作为标志物，能够特异性的区分新冠变异株gamma和普通新型冠状病毒。本试剂盒对口腔拭子、鼻咽拭子、痰液中的新冠病毒进行快速地鉴定，具有良好的灵敏度和准确度，且能避免其他类型的常见病毒对实验结果的干扰，为新冠变异株gamma的鉴定提供可靠的实验依据。

技术特征：

1.检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr方法，其特征在于，使用新冠病毒gamma变异株的引物、荧光探针对新冠病毒gamma变异株进行检测；

2.如权利要求1所述的检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr方法，其特征在于，seq idno.1～seq id no.8所示的引物在pcr反应体系中的终浓度为3～5pmol/μl，seq id no.9～seq id no.12所示的荧光探针在pcr反应体系中的终浓度为0.5～0.8pmol/μl。

3.如权利要求1所述的检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr方法，其特征在于，所述5’端荧光基团为fam、vic、rox、cy3和cy5中的一种或多种，所述3’端猝灭基团为eclipse、bhq1,、bhq2和mgb中的一种或多种。

4.一种检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括pcr反应液1、pcr反应液2和质控品；所述pcr反应液1包含无rna酶水、反转录酶、dna聚合酶、ung酶、dntps、甘油、hepes、tris-hcl缓冲液、mgso4和seq id no.9～seq id no.12所示的荧光探针；所述pcr反应液2包含无rna酶水、mgcl2、叠氮化钠和seq id no.1～seq id no.8所示的引物。

5.如权利要求4所述的一种检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr试剂盒，其特征在于，所述dna聚合酶的终浓度为4～6u，ung酶的终浓度为0.06～0.12u，dntps的终浓度为0.65～0.15mmol/l，tris-hcl缓冲液的终浓度为50～55mmol/l，mgso4的终浓度为2～8mmol/l，甘油的终浓度为10％～20％(质量)，hepes的终浓度为15％～20％(质量)、mgcl2的终浓度为15-30mmol/l、叠氮化钠的终浓度为0.05％-0.1％(质量)。

6.如权利要求1或2所述的检测新冠病毒gamma变异株的qrt-pcr方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明涉及检测试剂领域，特别涉及检测标志物、引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒。本发明提供了检测新冠变异株Gamma的引物、探针和试剂盒。本试剂盒对口腔拭子、鼻咽拭子、痰液中的新冠病毒进行快速地检测鉴定，具有良好的灵敏度和准确度，且能避免其他类型的常见病毒对实验结果的干扰，为新冠变异株Gamma的检测提供可靠的实验依据。

技术研发人员：邵丹,刘金贵,胡晓飞,董雯
受保护的技术使用者：山东博科生物产业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15