一种莱克多巴胺的兔单克隆抗体及其制备方法和应用

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种莱克多巴胺的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、莱克多巴胺(ractopamine，rac)是主要的β–肾上腺素激动剂之一，可用于促进动物生长和提高瘦肉/脂肪比。然而近年来莱克多巴胺频繁滥用，通过动物源性产品过度摄入β–肾上腺素能激动剂可导致严重的生理副作用，如肌肉疼痛、头晕、心动过速、紧张等，甚至死亡。对动物尿液中rac残留高效检测是监管rac非法使用的有效方法。

2、免疫分析方法是基于抗原抗体的反应，由于其成本低、易使用和高通量等优点，已成为检测化学污染物最重要的工具之一。单克隆抗体(monoclonal antibody，mabs)是免疫分析的核心试剂，它决定分析方法的灵敏度、分析时间、准确性和精准度。而提高检测灵敏度、简化检测程序并缩短检测时间是发展rac高通量痕量筛选方法的首要任务。目前rac免疫分析方法的核心试剂大多数是鼠单克隆抗体(mouse monoclonal antibody，mmabs)，但恶劣的尿液检测环境会严重损害免疫分析的检测性能。尿素作为尿液中的主要成分之一，研究表明它对mmab的固有结构会产生显著的变性影响，并干扰其生物学功能。这使得mmab在含有大量尿素的复杂尿液样本的免疫分析方法中应用效果较差。而前期研究证明，简单稀释尿液并不能有效消除尿素的影响。近年来，一些基于mmab的侧流免疫分析法或间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，icelisa)等免疫分析方法用于检测尿液中rac，这些方法不仅缺乏足够的灵敏度来满足微量rac检测的要求，而且需要多重样品预处理。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种莱克多巴胺的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。

2、第一方面，本发明提供一种莱克多巴胺的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括抗体重链和抗体轻链，

3、所述兔单克隆抗体的重链可变区包括如seq id no.1或seq id no.2所示的氨基酸序列；所述兔单克隆抗体的轻链可变区包括如seq id no.3或seq id no.4所示的氨基酸序列。

4、本研究通过一种竞争性筛选方法，筛选出分泌rac特异性抗体的的抗体分泌细胞，制备了一株在高尿素环境中具有惊人耐受性且保留对rac高亲和力的兔单克隆抗体(rabbit monoclonal antibody，rmabs)。并且相应地建立了一种基于rmab的稳定、快速的icelisa方法，可直接检测尿液中rac，无需任何样品预处理，检测性能显著提高，为体外制备其他尿素耐受抗体奠定了基础。

5、莱克多巴胺的化学式如下所示：

6、

7、本发明进一步提供用于编码所述兔单克隆抗体的核酸。

8、进一步地，所述核酸包括如seq id no.5-8所示的核苷酸序列中的一种或多种。

9、本发明进一步提供包括所述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

10、本发明进一步提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的兔单克隆抗体，或所述核酸，或所述生物材料。

11、第二方面，本发明提供一种兔单克隆抗体的制备方法，包括：

12、获得经过莱克多巴胺免疫原免疫的兔子的淋巴细胞，通过竞争筛选得到特异性分泌兔单克隆抗体的细胞；

13、所述竞争筛选包括：

14、在纳米孔板上包被莱克多巴胺包被原，在封闭后向所述纳米孔板的孔中加入所述淋巴细胞和经过荧光标记的二抗，等待所述淋巴细胞分泌莱克多巴胺特异性抗体之后向所述纳米孔板的孔中加入莱克多巴胺，根据所述纳米孔板的孔的荧光强度筛选得到特异性分泌针对莱克多巴胺的兔单克隆抗体的细胞。

15、进一步地，所述根据所述纳米孔板的孔的荧光强度筛选得到特异性分泌针对莱克多巴胺的兔单克隆抗体的细胞为：

16、筛选同时满足如下条件的细胞：

17、i)在所述等待所述淋巴细胞分泌莱克多巴胺特异性抗体的过程中荧光强度上升；

18、ii)在所述向所述纳米孔板的孔中加入莱克多巴胺之后荧光强度下降。

19、进一步地，所述莱克多巴胺免疫原为通过莱克多巴胺连接血蓝蛋白得到；和/或，所述莱克多巴胺包被原为通过莱克多巴胺连接牛血清蛋白得到。

20、进一步地，所述获得经过莱克多巴胺免疫原免疫的兔子的淋巴细胞包括：

21、针对兔子采用莱克多巴胺免疫原进行四次免疫，第一次免疫采用0.4～0.8mg/只的量进行免疫，第二次至第四次免疫为从第一次免疫开始计数，每21～27天进行一次免疫，用量为1～1.2mg/只。

22、本发明进一步提供所述兔单克隆抗体，或所述的核酸，或所述的生物材料，或所述的试剂盒，或所述的制备方法制备得到的兔单克隆抗体在检测莱克多巴胺中的应用；优选在检测尿液中莱克多巴胺中的应用。

23、本发明具备如下有益效果：

24、本发明首次制备了一株rac特异性rmab1，其亲和力为0.007ng/ml，可以耐受3m尿素，这有利于在无样品预处理的尿液中建立稳定的rac免疫分析方法。

25、本发明基于rmab1建立的间接竞争酶联免疫吸附法对rac的检测限为0.0042～0.014μg/l，猪、羊和牛尿液的变异系数低于11.7％，灵敏度显著提高10～100倍。因此，本发明提供的极耐尿素的超灵敏兔单克隆抗体在科研与实际应用中具有较为开阔的前景。

技术特征：

1.一种莱克多巴胺的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体包括抗体重链和抗体轻链，

2.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1所述的兔单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，包括如seq id no.5-8所示的核苷酸序列中的一种或多种。

4.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求2或3所述的核酸；所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的兔单克隆抗体，或权利要求2或3所述核酸，或权利要求3或4所述生物材料。

6.一种兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述根据所述纳米孔板的孔的荧光强度筛选得到特异性分泌针对莱克多巴胺的兔单克隆抗体的细胞为：

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述莱克多巴胺免疫原为通过莱克多巴胺连接血蓝蛋白得到；和/或，所述莱克多巴胺包被原为通过莱克多巴胺连接牛血清蛋白得到。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述获得经过莱克多巴胺免疫原免疫的兔子的淋巴细胞包括：

10.权利要求1所述的兔单克隆抗体，或权利要求2或3所述的核酸，或权利要求4所述的生物材料，或权利要求5所述的试剂盒，或权利要求6-9任一项所述的制备方法制备得到的兔单克隆抗体在检测莱克多巴胺中的应用；优选在检测尿液中莱克多巴胺中的应用。

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种莱克多巴胺的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。所述兔单克隆抗体包括抗体重链和抗体轻链，所述兔单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述兔单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本发明研究得到一种检测莱克多巴胺的兔单克隆抗体，其对于尿素具有较高的耐受性，在检测动物尿液中莱克多巴胺的领域具有重要意义。

技术研发人员：王战辉,沈建忠,温凯,余文博,于雪芝,江海洋,李园,刘明刚
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12