螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法

本发明属于藻蓝蛋白制备，尤其涉及一种螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法。

背景技术：

1、藻蓝蛋白(phycocyanin)是一种存在于蓝藻中，含开链四吡咯构造的天然蓝色素，具有吸收和传递功能的性质，属胞内蛋白，在螺旋藻中含量较高。由于藻蓝蛋白具有极高的营养价值以及抗炎、抗疲劳、抗肿瘤、提高人体免疫力等药理作用，因而被普遍应用于食品、化妆品、保健品和医药等领域，具有广阔的应用前景。

2、藻蓝蛋白提取纯化主要分为破壁、粗提和纯化3步，其中细胞破碎的方法有溶胀法、超声波细胞破壁法、冻融法、机械破壁法、化学试剂法、溶酶法等，试验中常用其中一种或两种方法联用对藻蓝蛋白进行破壁。藻蓝蛋白提取一般采用盐析法、等电点沉淀法、超滤法和吸附法，其中吸附法是利用吸附剂吸附杂质或蛋白从而提取蛋白，常用的吸附剂有活性炭和壳聚糖。此方法相比盐析法，所用的试剂价格便宜、不造成环境污染且用量较少，少量的吸附剂即可吸附杂质，无需大量的硫酸铵，但其缺点是需要精确控制吸附剂的用量和吸附时间，否则容易将目标蛋白吸附走，降低提取率。总的来说此方法有很大的开发潜力，有望取代盐析法提取藻蓝蛋白，但目前国内外对此方法的研究较少。

3、综上，目前藻蓝蛋白的提取纯化工艺较成熟，但仍仅适用于试验室操作，特别是高纯度藻蓝蛋白的提取成本高、价格昂贵，工业上大规模生产仍是其重难点所在。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、效率高、实用性强的螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，包括溶胀法破壁、活性炭吸附法提取和疏水层析纯化三个步骤；溶胀法破壁中料液比1:10～1:200、溶胀时间6～36h、溶胀次数1～3次；活性炭吸附法提取中活性炭数目100～500目、活性炭加入量0.1～0.9g/20ml、吸附时间5～25min；疏水层析纯化中疏水层析填料为butyl fourose 4ff疏水层析填料，洗脱液梯度依次为含0.6mol/l硫酸铵的0.05mol/l pbs、含0.3mol/l硫酸铵的0.05mol/l pbs、0.05mol/lpbs、纯水。

4、溶胀法破壁中料液比1:20、溶胀时间24h、溶胀次数2次；活性炭吸附法提取中活性炭数目300目、活性炭加入量0.5g/20ml、吸附时间10min。

5、该法中所用螺旋藻为钝顶螺旋藻干粉。

6、溶胀法破壁按以下进行操作：精密称取螺旋藻干粉，按料液比加入纯水进行溶胀，反复多次溶胀，合并每次溶胀所得藻液，后经超声静置离心得上清液一。

7、活性炭吸附法提取按以下进行操作：取溶胀所得的上清液一，加入活性炭静置吸附，经离心得上清液二。

8、疏水层析纯化按以下进行操作：将活性炭吸附法提取后所得上清液二，经超滤浓缩后，采用含0.6mol/l硫酸铵的0.05mol/l pbs磷酸缓冲液预平衡的疏水层析填料进行梯度洗脱，流速控制为2ml/min，3min/管，分别合并纯度1-2，2-3和大于3的蛋白液。

9、超滤浓缩截留5000mwco(molecular weight cut off,mwco截留分子量)。

10、该法所得藻蓝蛋白为食品级藻蓝蛋白或医药级藻蓝蛋白。

11、针对目前蓝蛋白制备存在的问题，发明人建立了一种螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，包括溶胀法破壁、活性炭吸附法提取和疏水层析纯化三个步骤。其中，发明人以藻蓝蛋白纯度和回收率为指标，考察了溶胀法破壁、活性炭吸附法提取工艺步骤中影响因素对产品的影响，并结合响应面法优化确定了最佳工艺参数条件：溶胀法破壁中料液比1:20、溶胀时间24h、溶胀次数2次；活性炭吸附法提取中活性炭数目300目、活性炭加入量0.5g/20ml、吸附时间10min。最后一步采用疏水层析法纯化得到食品级藻蓝蛋白(p≥0.7)和医药级藻蓝蛋白(p≥3.0)，总回收率为61.15％。因此，本发明溶胀-活性炭吸附-疏水层析三步提纯藻蓝蛋白工艺合理可行，实现了医药级藻蓝蛋白的分离提纯，降低了工业生产成本，具有实用价值。总之，本发明工艺成本低、效率高、实用性强，适用于规模化工业生产高纯度藻蓝蛋白。

技术特征：

1.一种螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于包括溶胀法破壁、活性炭吸附法提取和疏水层析纯化三个步骤；所述溶胀法破壁中料液比1:10～1:200、溶胀时间6～36h、溶胀次数1～3次；所述活性炭吸附法提取中活性炭数目100～500目、活性炭加入量0.1～0.9g/20ml、吸附时间5～25min；所述疏水层析纯化中疏水层析填料为butyl fourose 4ff疏水层析填料，洗脱液梯度依次为含0.6mol/l硫酸铵的0.05mol/l pbs、含0.3mol/l硫酸铵的0.05mol/l pbs、0.05mol/l pbs、纯水。

2.根据权利要求1所述的螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于：所述溶胀法破壁中料液比1:20、溶胀时间24h、溶胀次数2次；所述活性炭吸附法提取中活性炭数目300目、活性炭加入量0.5g/20ml、吸附时间10min。

3.根据权利要求1所述的螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于该法中所用螺旋藻为钝顶螺旋藻干粉。

4.根据权利要求1所述的螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述溶胀法破壁按以下进行操作：精密称取螺旋藻干粉，按料液比加入纯水进行溶胀，反复多次溶胀，合并每次溶胀所得藻液，后经超声静置离心得上清液一。

5.根据权利要求4所述的螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述活性炭吸附法提取按以下进行操作：取溶胀所得的上清液一，加入活性炭静置吸附，经离心得上清液二。

6.根据权利要求5所述的螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述疏水层析纯化按以下进行操作：将活性炭吸附法提取后所得上清液二，经超滤浓缩后，采用含0.6mol/l硫酸铵的0.05mol/l pbs磷酸缓冲液预平衡的疏水层析填料进行梯度洗脱，流速控制为2ml/min，3min/管，分别合并纯度1-2，2-3和大于3的蛋白液。

7.根据权利要求5所述的螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于：所述超滤浓缩截留5000mwco。

8.根据权利要求1所述的螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，其特征在于该法所得藻蓝蛋白为食品级藻蓝蛋白或医药级藻蓝蛋白。

技术总结
本发明公开了一种螺旋藻藻蓝蛋白的提取纯化方法，包括溶胀法破壁、活性炭吸附法提取和疏水层析纯化三个步骤。其中，发明人以藻蓝蛋白纯度和回收率为指标，考察了溶胀法破壁、活性炭吸附法提取工艺步骤中影响因素对产品的影响，并结合响应面法优化确定了最佳工艺参数条件。最后一步采用疏水层析法纯化得到食品级藻蓝蛋白(P≥0.7)和医药级藻蓝蛋白(P≥3.0)，总回收率为61.15％。因此，本发明溶胀‑活性炭吸附‑疏水层析三步提纯藻蓝蛋白工艺合理可行，实现了医药级藻蓝蛋白的分离提纯，降低了工业生产成本，具有实用价值。总之，本发明工艺成本低、效率高、实用性强，适用于规模化工业生产高纯度藻蓝蛋白。

技术研发人员：张玲,陈盛仕,刘梓宜,李梦琪,米顺利,陈显强
受保护的技术使用者：广西中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12