一种启动子及其在增强基因表达中的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种启动子及其在增强基因表达中的应用。

背景技术：

1、启动子是决定基因表达模式的重要元件。启动子包括转录起始位点，tata框和上游启动子元件，分为组成型、组织特异型和诱导型等几个种类。具有特定特性的启动子在基因工程领域具有很大的价值，例如camv 35s、actin、ubiquitin等组成型启动子常用于超量表达目的基因；而rbcs等各种组织特异型启动子可用于目的基因的组织特异性表达。然而，受到研究手段的限制，可用的功能明确的启动子仍然相对较少，不能满足需求。

2、利用报告基因测定启动子活性以及通过不同长度的启动子片段活性测试确定启动子中的顺式元件是全面研究启动子功能的常用手段，然而这种方法获得的结果并不能直接反映启动子在“原位”上的功能，从而影响结果的可靠性。

3、基因编辑是对物种进行性状改良的有效工具。除了能够对基因进行编辑外，也可以对启动子进行编辑，通过改变启动子特性改变基因的表达，从而实现性状改良的效果。例如，修饰水稻ossweet基因启动子可以提高水稻对白叶枯病的抗性(oliva,r.,ji,c.,atienza-grande,g.et al.broad-spectrum resistance to bacterial blight in riceusing genome editing[j].nat biotechnol.,2019,37,1344-1350)；编辑番茄中的slclv3等启动子可以获得连续变化的表型，从而可以对表型进行微调(rodríguez-leal d,lemmonz h,man j,et al.engineering quantitative trait variation for crop improvementby genome editing[j].cell,2017,171:470-480.e8.)。

4、因此，在“原位”上鉴定启动子中的顺式元件功能，获得能改变基因表达模式的启动子变异对于性状的遗传改良具有重要意义。由于启动子结构的复杂性(影响基因表达的区域可能分布在转录起始位点前的2kb甚至是5kb范围内)和不可预测性(虽然可以初步预测常用顺式元件的位置，但是预测结果并不可靠)，一种在“原位”上高通量鉴定启动子顺式元件和创制有功能的启动子变异的方法就具有很大的价值。

5、cn113061602a专利公开了一种高通量启动子变异创制方法。本发明采用类似的方法获得了一种具有增强基因表达效果的新型启动子。该启动子可以用于增强基因表达。另一方面，本发明还提供了一种提高玉米籽粒中维生素e含量的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新型启动子。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种启动子，其特征在于：所述启动子序列如seq id no.1所示。

4、本发明还提供一种表达盒，其特征在于：由上述的启动子、编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子、seq id no.3所示序列的终止子顺序连接而成。其中seq id no.2是vte4基因编码的氨基酸序列。seq id no.3是nos终止子序列。

5、在一些实施方案中，上述编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.5所示。seq id no.4是vte4基因组序列，seq id no.5是vte4基因cds编码区序列。

6、本发明还提供一种提高玉米籽粒中维生素e含量的方法，其特征在于：包括如下任一种：

7、(1)使用基因工程手段同时靶向修改seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示的玉米基因组区域序列，选择玉米籽粒中维生素e含量提高的植株；

8、(2)将含有上述的表达盒插入玉米基因组，选择玉米籽粒中维生素e含量提高的植株。

9、在一些实施方案中，上述的基因工程手段采用crispr/cas9基因编辑方法。

10、本发明还提供一种提高玉米籽粒中维生素e含量的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

11、(1)能够同时识别seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示靶标序列的rna分子；该rna分子可以是包含grna、crrnas和tracrrna结构的sgrna分子，也可以是grna、crrnas和tracrrna单独形成的复合体，或包括grna、crrnas的复合体；在一些实施方案中，上述的rna分子为seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11所示序列的组合。

12、(2)编码(1)所述rna的dna分子；

13、(3)表达(1)所述rna的载体。

14、本发明还提供上述的启动子在增强基因表达中的应用。

15、上述的表达盒、方法、试剂盒在提高玉米籽粒中维生素e含量中的应用。

16、本发明的创新性及有益效果如下：在启动子结构的复杂性和不可预测性的背景下，本发明获得了一种新型的启动子。该启动子具有增强基因表达的功能。另一方面，本发明还提供了一种新型的提高玉米籽粒维生素e含量的方法。

技术特征：

1.一种启动子，其特征在于：所述启动子序列如seq id no.1所示。

2.表达盒，其特征在于：由权利要求1所述的启动子、编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子、seq id no.3所示序列的终止子顺序连接而成；任选地，所述编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.5所示。

3.一种提高玉米籽粒中维生素e含量的方法，其特征在于：包括如下任一种：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的基因工程手段采用crispr/cas9基因编辑方法。

5.一种提高玉米籽粒中维生素e含量的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的rna分子为seq id no.9、seq idno.10、seq id no.11所示序列的组合。

7.权利要求1所述的启动子在增强基因表达中的应用。

8.权利要求2所述的表达盒、权利要求3-4任一项所述的方法、权利要求5-6任一项所述的试剂盒在提高玉米籽粒中维生素e含量中的应用。

技术总结
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种启动子及其在增强基因表达中的应用。本发明通过使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因启动子区域进行饱和突变，获得一种具有增强基因表达效果的新型启动子。该启动子可以用于增强基因表达。另一方面，本发明还提供了一种提高玉米籽粒中维生素E含量的方法。

技术研发人员：许洁婷,金敏亮,韩宝柱,潘弘,吴晓昱,李梦娇
受保护的技术使用者：未米生物科技（江苏）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13