一种新型FXR荧光探针化合物及其制备方法与应用与流程

一种新型fxr荧光探针化合物及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型fxr荧光探针化合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.法尼酯衍生物x受体(farnesoid x receptor，fxr)是一种胆汁酸受体，属于核受体超家族成员，是依赖配体激活的转录因子，可调控多种靶基因的转录。fxr靶基因包括胆汁酸、脂类和糖类等代谢的相关基因，是近年来治疗一系列代谢性疾病的新型药物靶点，比如胆汁淤积、非酒精性脂肪肝病、非小细胞肺癌、高血脂等。最新研究表明fxr拮抗剂可以下调sars-cov-2的ace2表达，降低sars-cov-2进入和感染宿主细胞，因此fxr拮抗剂有望成为治疗抗新冠病毒的一种潜在药物。
3.高通量药物筛选是对药物进行微量、快速、大规模筛选的检测方法。通过分析筛选结果中受体的亲和力、专一性以及对受体功能影响等多个角度，探寻具有激动或拮抗活性的化合物，并据此研发出有效的受体药物。现今已经建立了许多筛选方法。比如在蛋白水平上的荧光偏振(fluorescence polarization，fp)、时间分辨荧光共振能量转移(time resolution fluorescent resonance energy transfer，tr-fret)等，这两种方法都需要荧光标记的共辅因子多肽，其制备复杂、价格昂贵，而且荧光偏振法蛋白质用量大。细胞水平上筛选实验的有细胞活力(cell viability)、报告基因(reporter gene)等，存在着影响因素多、筛选周期长、实验试剂昂贵等缺点。
4.时间分辨荧光共振能量转移竞争性结合实验(competitive time resolution fluorescent resonance energy transfer competitive binding assay，tr-fret竞争性结合实验)与tr-fret类似，采用了时间分辨荧光和共振能量转移两种技术。时间分辨荧光利用发射长半衰期荧光信号的镧系元素作为荧光基团来降低背景信号值干扰。共振能量转移是指两个合适的荧光基团之间的距离合适时(一般小于10nm)会发生荧光能量从供体向受体转移的现象。tr-fret因供体荧光基团发射光有较长半衰期，供受体荧光基团的激发和发射都可以在短半衰期背景荧光消失后再检测。tr-fret竞争性结合实验与tr-fret不同的是，它不需要昂贵的共辅因子多肽；而是通过荧光基团标记受体蛋白的已知活性配体，待测配体与已知活性配体同时和受体蛋白进行竞争性取代结合(实验原理示意图如图1)。这种方法检测速度快、成本低、试剂用量少，非常适合用于高通量药物筛选。以fxr核受体为靶点高效、快速筛选fxr的活性配体，对于预防或治疗与fxr相关的疾病具有非常重要的意义，然而目前还没有基于时间分辨荧光共振能量转移竞争性结合实验筛选fxr的活性配体的报道。


技术实现要素：

5.本发明第一方面的目的，在于提供一种化合物。
6.本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的化合物的制备方法。
7.本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的化合物的应用。
8.本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂。
9.本发明第五方面的目的，在于提供一种试剂盒。
10.本发明第六方面的目的，在于提供一种检测系统。
11.本发明第七方面的目的，在于提供一种筛选fxr配体的方法。
12.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
13.本发明的第一个方面，提供一种化合物，其化学结构式如式(ⅰ)所示：
[0014][0015]
式(ⅰ)中，n选自0、2、3、4、5、6。
[0016]
优选地，n选自0、2、3、4。
[0017]
优选地，n选自0、2、4。
[0018]
优选地，n选自2。
[0019]
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0020]
s21：将奥贝胆酸和有机中间体进行酰胺反应，得到中间体2a，所述有机中间体包含：单boc肼、单boc乙二胺、单boc丙二胺、单boc丁二胺、单boc戊二胺、单boc己二胺中的至少一种；
[0021]
s22：对中间体2a进行脱保护反应，脱保护后的中间体2a与异硫氰酸荧光素进行亲核加成反应，得到本发明第一个方面的化合物。
[0022]
优选地，s21中所述的酰胺反应按照常规的酰胺反应条件进行，比如：室温过夜。
[0023]
优选地，s21中所述的酰胺反应选用的有机溶剂包含：dmf、dhf、乙腈中的至少一种；进一步包含dmf。
[0024]
优选地，s21中所述的酰胺反应选用的缩合剂包含：hatu、pyboc、hoat、hobt、hbtu、bop中的至少一种；进一步包含hatu。
[0025]
优选地，s21中所述的酰胺反应选用的碱包含：n，n-二异丙基乙胺、三乙胺中的至少一种；进一步包含：n,n-二异丙基乙胺。
[0026]
优选地，s21中所述奥贝胆酸和有机中间体的摩尔比为1:2～1:4。
[0027]
优选地，s21中所述反应后还包含如下步骤：将反应后的溶液在有机溶剂和水中分配，保留有机相，洗涤，干燥。
[0028]
优选地，s21中所述反应后还包含如下步骤：将反应后的溶液在有机溶剂和水中分配，保留有机相，水相有机溶剂萃取一次，合并有机相，洗涤，干燥。
[0029]
优选地，所述有机溶剂包含：乙酸乙酯。
[0030]
优选地，所述洗涤包含：柠檬酸水溶液洗涤、饱和碳酸氢钠洗涤和氯化钠溶液洗涤。
[0031]
优选地，所述干燥采用硫酸钠干燥。
[0032]
优选地，s22中所述的脱保护反应按照常规的脱保护反应条件进行，比如：室温过夜。
[0033]
优选地，s22中所述脱保护反应选用的有机溶剂包含：dcm、1，4-二氧六环、dmf、thf中的至少一种；进一步包含：dcm。
[0034]
优选地，s22中所述脱保护反应选用的酸包含：tfa、hcl、醋酸中的至少一种；进一步包含：tfa。
[0035]
优选地，s22中所述脱保护反应后还包括如下步骤：浓缩除去有机溶剂。
[0036]
优选地，s22中所述的亲核加成反应按照常规的亲核加成反应条件进行，比如：室温避光过夜。
[0037]
优选地，s22中所述的亲核加成反应选用的有机溶剂包含：1，4-二氧六环、dmf、thf、乙醇中的至少一种；进一步包含：thf和乙醇。
[0038]
优选地，所述thf和乙醇的体积比为(1～3)：1。
[0039]
优选地，s22中所述的亲核加成反应选用的碱包含：n，n-二异丙基乙胺、三乙胺中的至少一种；进一步包含：三乙胺。
[0040]
优选地，s22中所述的亲核加成反应后还包含如下步骤：干燥、纯化。
[0041]
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的化合物的应用，具体如下：
[0042]
a1)本发明第一个方面的化合物作为荧光探针在筛选fxr配体中的应用；
[0043]
a2)本发明第一个方面的化合物在制备筛选fxr配体的产品中的应用。
[0044]
优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、检测系统中的至少一种。
[0045]
优选地，所述fxr配体包括fxr激动剂、fxr拮抗剂中的至少一种；进一步包含fxr激动剂和fxr拮抗剂。
[0046]
本发明的第四个方面，提供一种试剂，包含本发明第一个方面的化合物。
[0047]
优选地，所述试剂用于筛选fxr配体。
[0048]
优选地，所述fxr配体包括fxr激动剂、fxr拮抗剂中的至少一种；进一步包含fxr激动剂和fxr拮抗剂。
[0049]
本发明的第五个方面，提供一种试剂盒，包含b1)～b2)中至少一种：
[0050]
b1)本发明第一个方面的化合物；
[0051]
b2)本发明第四个方面的试剂。
[0052]
优选地，所述试剂盒还包含：包含fxr配体结合域(fxr-lbd)的蛋白，所述蛋白连接有标签蛋白。
[0053]
优选地，所述试剂盒还包含：镧系元素标记的抗所述标签蛋白抗体。
[0054]
优选地，所述标签蛋白包含：c-myc、his、gst、ha、flag中的至少一种；进一步包含：his。
[0055]
优选地，所述镧系元素包含：la、sc、y、ce、pr、nd、pm、sm、eu、gd、tb、dy、ho、er、tm、yb、lu中的至少一种；进一步包含tb。
[0056]
优选地，所述试剂盒还包含：缓冲液。
[0057]
优选地，所述缓冲液包含pbs缓冲液、tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的至少一种。
[0058]
优选地，所述缓冲液为包含tween20的缓冲液。
[0059]
优选地，所述试剂盒用于筛选fxr配体。
[0060]
优选地，所述fxr配体包括fxr激动剂、fxr拮抗剂中的至少一种；进一步包含fxr激动剂和fxr拮抗剂。
[0061]
本发明的第六个方面，提供一种检测系统，包含：c1)～c3)中至少一种和酶标仪：
[0062]
c1)本发明第一个方面的化合物；
[0063]
c2)本发明第四个方面的试剂；
[0064]
c3)本发明第五个方面的试剂盒。
[0065]
优选地，所述检测系统用于筛选fxr配体。
[0066]
优选地，所述fxr配体包括fxr激动剂、fxr拮抗剂中的至少一种；进一步包含fxr激动剂和fxr拮抗剂。
[0067]
本发明的第七个方面，提供一种筛选fxr配体的方法，包含：采用d1)～d4)中至少一种的步骤；
[0068]
d1)本发明第一个方面的化合物；
[0069]
d2)本发明第四个方面的试剂；
[0070]
d3)本发明第五个方面的试剂盒；
[0071]
d4)本发明第六个方面的检测系统。
[0072]
优选地，所述方法包括如下步骤：
[0073]
s1：将包含fxr配体结合域(fxr-lbd)的蛋白，所述蛋白连接有标签蛋白、镧系元素标记的抗所述标签蛋白抗体、本发明第一个方面的化合物和待测物质混合得混合物；
[0074]
s2：利用荧光共振能量转移技术测定混合物的信号值，根据信号值确认待测物质是否为fxr配体。
[0075]
优选地，所述蛋白在所述混合物中的浓度为8～20nm。
[0076]
优选地，所述抗体在所述混合物中的浓度为0.8～20nm。
[0077]
优选地，所述化合物在所述混合物中的浓度为120～200nm。
[0078]
优选地，所述fxr配体包括fxr激动剂、fxr拮抗剂中的至少一种；进一步包含fxr激动剂和fxr拮抗剂。
[0079]
本发明的有益效果是：
[0080]
本发明提供了一种化合物，该化合物可以作为荧光探针用于筛选fxr配体，其制备简单、结构稳定、灵敏度高、检测速度快，适用于高通量筛选fxr配体，其用于筛选fxr配体时采用竞争性结合tr-fret筛选体系(不同于传统的荧光偏振体系)，其不仅适用于筛选fxr激动剂，还可用于筛选fxr拮抗剂(传统的荧光偏振体系仅能筛选fxr激动剂)。
附图说明
[0081]
图1是tr-fret竞争性结合实验的原理示意图。
[0082]
图2是新型fxr荧光探针(化合物b)的合成路线图。
[0083]
图3是新型fxr荧光探针(化合物a)的合成路线图。
[0084]
图4是新型fxr荧光探针(化合物c)的合成路线图。
[0085]
图5是新型fxr荧光探针(化合物a、化合物b、化合物c)的薛定谔虚拟分子对接和gromacs动力学模拟图：其中，a是新型fxr荧光探针(化合物a、化合物b、化合物c)的薛定谔虚拟分子对接图；b是新型fxr荧光探针(化合物a、化合物b、化合物c)的gromacs动力学模拟图。
[0086]
图6是新型fxr荧光探针(化合物a、化合物b、化合物c)与ivermectin的tr-fret竞争性结合实验曲线图。
[0087]
图7是利用新型fxr荧光探针(化合物b)的tr-fret竞争性结合实验的z
’‑
factor测试结果图。
[0088]
图8是采用新型fxr荧光探针(化合物b)和dy246荧光探针的tr-fret竞争性结合实验曲线图：其中，a是采用新型fxr荧光探针(化合物b)的tr-fret竞争性结合实验曲线图；b是采用dy246荧光探针的tr-fret竞争性结合实验曲线图。
[0089]
图9是采用新型fxr荧光探针(化合物b)和采用传统tr-fret体系筛选商业化激素核受体化合物库的tr-fret竞争性结合实验结果图：其中，a是采用新型fxr荧光探针(化合物b)筛选商业化激素核受体化合物库的tr-fret竞争性结合实验结果图；b是采用传统tr-fret体系筛选商业化激素核受体化合物库的tr-fret竞争性结合实验结果图。
[0090]
图10是用新型fxr荧光探针(化合物b)和cdca-f的tr-fret竞争性结合实验曲线图。
[0091]
图11是化合物a的核磁图谱。
[0092]
图12是化合物b的核磁图谱。
[0093]
图13是化合物c的核磁图谱。
具体实施方式
[0094]
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
[0095]
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0096]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0097]
实施例1化合物a的制备
[0098]
化合物a的合成路线图如图3所示，具体步骤如下：将奥贝胆酸(50mg，0.119mmol)溶于1ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温加入肼基甲酸叔丁酯(单boc肼，47mg，0.357mmol)，加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu，45mg，0.119mmol)，加入n,n-二异丙基乙胺(dipea，46mg，0.357mmol)，室温过夜。然后反应液在乙酸乙酯(ea)和水中分配，保留有机相，水相ea萃取一次，合并有机相，0.1g/ml柠檬酸水溶液洗涤，饱和碳酸氢钠洗涤，氯化钠溶液洗，硫酸钠干燥。干燥后得到的产物溶于约1ml二氯甲烷(dcm)中，室温加入0.25ml的三氟乙酸(tfa)，反应过夜，浓缩除去溶剂，用于下一步。除去溶剂后的产物加入适量的三乙胺(tea)使ph为11，再溶于1ml四氢呋喃(thf)和乙醇(etoh)
的混合溶剂中(vthf：vetoh＝2：1)，加入异硫氰酸荧光素(fitc，46mg，0.119mmol)，室温避光过夜，浓缩干燥，半制备纯化(柱型号：xbridge prep c18 5μm obd
tm 19*250mm column；洗脱液：a流动相乙腈(acn)/甲醇(meoh)＝1：1(v/v)，b流动相水(with 0.1％tfa)，梯度：0min 60％a～30min 90％a，流速：10ml/min，产物特征：磷钼酸强显色，365nm强黄色荧光)，得到化合物a。化合物a的核磁图谱如图11所示(1h nmr(600mhz,methanol-d4)δ＝8.32(s,1h),7.96(d,j＝8.3,2.1,1h),7.23(d,j＝8.2,1h),7.01(d,j＝8.9,2h),6.91(s,2h),6.77(d,2h),3.63(t,j＝2.8,1h),3.32(s,4h),2.39(ddd,j＝15.0,10.2,5.1,1h),2.25(ddd,j＝14.4,9.9,6.4,1h),2.01
–
1.96(m,1h),1.95
–
1.75(m,4h),1.72(td,j＝10.0,6.3,3h),1.57(d,j＝11.2,1h),1.54
–
1.41(m,11h),1.42
–
1.30(m,3h),1.28(dp,j＝11.9,4.0,3.3,2h),1.23
–
1.13(m,3h),1.08(qd,j＝11.9,6.2,1h),0.99(d,j＝6.6,3h),0.88(s,3h),0.87(t,j＝7.3,3h),0.67(s,3h))。
[0099]
实施例2化合物b的制备
[0100]
化合物b的合成路线图如图2所示，具体步骤如下：将奥贝胆酸(50mg，0.119mmol)溶于1ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温加入n-叔丁氧羰基乙二胺(单boc乙二胺，19mg，0.357mmol)，加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu，45mg，0.119mmol)，加入n,n-二异丙基乙胺(dipea，46mg，0.357mmol)，室温过夜。然后反应液在乙酸乙酯(ea)和水中分配，保留有机相，水相ea萃取一次，合并有机相，0.1g/ml柠檬酸水溶液洗涤，饱和碳酸氢钠洗涤，氯化钠溶液洗，硫酸钠干燥。干燥后得到的产物溶于约1ml二氯甲烷(dcm)中，室温加入0.25ml的三氟乙酸(tfa)，反应过夜，浓缩除去溶剂，用于下一步。除去溶剂后的产物加入适量的三乙胺(tea)使ph为11，再溶于1ml四氢呋喃(thf)/乙醇(etoh)的混合溶剂中(vthf：vetoh＝2：1)，加入异硫氰酸荧光素(fitc，46mg，0.119mmol)，室温避光过夜，浓缩干燥，半制备纯化(柱型号：xbridge prep c18 5μm obd
tm 19*250mm column；洗脱液：a流动相乙腈(acn)/甲醇(meoh)＝1：1(v/v)，b流动相水(with 0.1％tfa)，梯度：0min 60％a～30min 90％a，流速：10ml/min，产物特征：磷钼酸强显色，365nm强黄色荧光)，得到化合物b。化合物b的核磁图谱如图12所示(1h nmr(600mhz,methanol-d4)δ＝8.25(s,1h),7.85(d,j＝8.2,1h),7.23(d,j＝8.3,1h),7.04(d,2h),6.92(s,2h),6.78(d,j＝8.8,2h),3.74(t,2h),3.59(t,j＝2.7,1h),3.43(t,j＝6.1,2h),3.32(s,4h),2.24(ddd,j＝14.7,10.1,5.1,1h),2.10(ddd,j＝13.9,9.7,6.5,1h),2.01(s,1h),1.93(d,j＝12.5,1h),1.89
–
1.62(m,7h),1.61
–
1.53(m,1h),1.51(tt,j＝6.4,3.8,1h),1.48
–
1.31(m,7h),1.27(tdd,j＝13.2,8.9,3.7,7h),1.17
–
1.07(m,2h),1.04(dp,j＝11.9,5.8,1h),0.96(td,j＝14.4,3.3,1h),0.91(d,j＝6.5,3h),0.86(s,3h),0.86(t,j＝7.4,3h),0.63(s,3h))。
[0101]
实施例3化合物c的制备
[0102]
化合物c的合成路线图如图4所示，具体步骤如下：将奥贝胆酸(50mg，0.119mmol)溶于1ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温加入n-叔丁氧羰基乙二胺(单boc丁二胺，27mg，0.357mmol)，加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu，45mg，0.119mmol)，加入n,n-二异丙基乙胺(dipea，46mg，0.357mmol)，室温过夜。然后反应液在乙酸乙酯(ea)和水中分配，保留有机相，水相ea萃取一次，合并有机相，0.1g/ml柠檬酸水溶液洗涤，饱和碳酸氢钠洗涤，氯化钠溶液洗，硫酸钠干燥。干燥后的产物溶于约1ml二氯甲烷(dcm)中，室温加入0.25ml的三氟乙酸(tfa)，反应过夜，浓缩除去溶剂，用于下一步。除
去溶剂的产物加入适量的三乙胺(tea)使ph为11，再溶于1ml四氢呋喃(thf)/乙醇(etoh)的混合溶剂中(vthf：vetoh＝2：1)，加入异硫氰酸荧光素(fitc，46mg，0.119mmol)，室温避光过夜，浓缩干燥，半制备纯化(柱型号：xbridge prep c18 5μmobd
tm 19*250mm column；洗脱液：a流动相乙腈(acn)/甲醇(meoh)＝1：1(v/v)，b流动相水(with 0.1％tfa)，梯度：0min 60％a～30min 90％a，流速：10ml/min，产物特征：磷钼酸强显色，365nm强黄色荧光)，得到化合物c。化合物c的核磁图谱如图13所示(1h nmr(600mhz,methanol-d4)δ＝8.12(s,1h),7.76(s,1h),7.47
–
7.26(m,1h),7.15(d,j＝8.2,1h),6.71(s,5h),6.61(d,j＝30.8,2h),3.61(s,3h),2.27
–
2.18(m,1h),2.16(d,j＝7.7,1h),2.08(ddd,j＝13.5,9.4,6.8,1h),1.99(ddd,j＝20.8,12.4,6.8,2h),1.94
–
1.87(m,0h),1.87
–
1.73(m,2h),1.73
–
1.63(m,4h),1.59
–
1.54(m,3h),1.53
–
1.39(m,4h),1.16
–
1.05(m,1h),0.94(d,j＝6.5,3h),0.92
–
0.84(m,9h),0.66(s,3h))。
[0103]
效果实施例1薛定谔虚拟分子对接和gromacs动力学模拟数据
[0104]
计算机辅助药物设计是当今药物化学行业不可或缺的一环，其精确的原子力场相互作用可以帮助研究人员从虚拟构象优化化合物结构以及探究蛋白质和化合物的结合模式。化合物a、化合物b、化合物c由软件chemdraw生成二维虚拟化合物构象，首先使用薛定谔对接软件对化合物添加拓扑力场(ligprep模块)(参照文献：opls3:a force field providing broad coverage of drug-like small molecules and proteins|journal of chemical theory and computation(acs.org))，通过计算原子间的相互作用力和拓扑异构形态生成可能的三维折叠形状；再转换输出的文件格式(从chemdraw生成的.cdxml转换成用于对接的.sdf格式)。然后下载fxr-lbd与奥贝胆酸的蛋白质晶体虚拟结构(pdb代码为1osv)，使用薛定谔的蛋白准备模块(protein preparation wizard)对蛋白结构进行前处理，包括删除多余水分子以及调整蛋白的结构形式、电荷和质子化状态；在蛋白质晶体虚拟结构1osv奥贝胆酸与fxr的结合处生成与化合物配体的虚拟对接盒子(receptor grid generation)，把化合物a、b、c与fxr重新对接计算(ligand docking)(参考文献：glide:a new approach for rapid,accurate docking and scoring.1.method and assessment of docking accuracy|journal of medicinal chemistry(acs.org))。薛定谔虚拟分子对接使用高精度模式(xp)，结果如图5中a所示，位于fxr蛋白质结合口袋的新型fxr荧光探针(化合物a(n＝0)、化合物b(n＝2)、化合物c(n＝4)，n为oca和fitc之间的链长，即式(ⅰ)所示的荧光探针中ch2的重复数)与n末端的另一荧光标记tb的荧光探针距离分别为30.18、26.31、30.76埃米。
[0105]
为了进一步校准力场提高原子间的相互作用达到更贴合实验的目的，发明人把静象的薛定谔对接构象使用gromacs进行动态的分子动力学分析，计算原子运动轨迹。首先把fxr-lbd和化合物a、b、c分别生成复合形式的坐标及其添加水溶液的外力作用参数系统文件；然后对系统进行经典的能量最小化、升温和平衡处理；最后运行分子运动仿真模拟计算(heterogeneous parallelization and acceleration of molecular dynamics simulations in gromacs:the journal of chemical physics:vol 153,no 13(scitation.org))。gromacs动力学模拟结果如图5中b所示，50ns时间范围内，荧光探针化合物a、化合物b、化合物c与fxr-lbd相互作用的平均氢键数量分别为3.47、5.26、4.81。综合薛定谔虚拟分子对接和gromacs动力学模拟的实验数据表明，n＝2的新型fxr荧光探针(化
合物b)的灵敏度最高。
[0106][0107]
效果实施例2采用tr-fret竞争性结合实验比较化合物a、化合物b、化合物c的灵敏度
[0108]
tr-fret竞争性结合实验操作流程如下：第一步，96孔板上每孔加入39.2μl含0.005％tween20的磷酸盐缓冲液(20mm phosphate buffer(磷酸盐缓冲液，kh2po4，k2hpo4)+50mm kcl+5mm tecp+0.5mm edta)；第二步，将浓度2mm的伊维菌素(ivermectin)按照1:3梯度稀释至第12个孔，加入到第一步的溶液混匀，每孔0.8μl；第三步，第一步的溶液每孔加入20μl 600nm新型fxr荧光探针(化合物a(n＝0)、化合物b(n＝2)、化合物c(n＝4)，终浓度为150nm)混匀；第四步，第一步的溶液每孔加入20μl含40nm his-fxr-lbd(氨基酸序列为：mahhhhhhvddddkmlevlfqgpeltpdqqtllhfimdsynkqrmpqeitnkilkeefsaeenfliltematnhvqvlveftkklpgfqtldhedqiallkgsaveamflrsaeifnkklpsghsdlleerirnsgisdeyitpmfsfyksigelkmtqeeyalltaivilspdrqyikdreaveklqeplldvlqklckihqpenpqhfacllgrltelrtfnhhhaemlmswrvndhkftpllceiwdvq，seq id no.1)和4nm anti-his-tb(thermofisher，货号pv5863)的混合溶液混匀；然后取75μl转移至384黑色孔板，每孔22.5μl，3个复孔。将混合液室温孵育30分钟后用酶标仪读数，激发波长和发射波长分别为495nm和520nm。使用graphpad prism 8.0软件进行作图，即可得到图6中的520/495比值曲线图。从图6可以看出，相同条件下n＝2的新型fxr荧光探针(化合物b)的检测窗口最大，说明n＝2的新型fxr荧光探针(化合物b)的灵敏度最高(以绝对表达值倍数变化(绝对表达值倍数变化(fold change)：用于描述一个初始值到一个最终值的变化程度；例如，若初始值为30，最终值为60，则相应的fold change为2)表征灵敏度；化合物b与化合物a的绝对表达值倍数变化约为9倍，化合物b与化合物c的绝对表达值倍数变化约为2倍。
[0109]
效果实施例3化合物b的z
’‑
factor测定
[0110]z’‑
factor是生物测定的统计数据质量指标，广泛应用于高通量筛选领域。在大多数药物的初级筛选期间，一个化学库中每个化合物只在一次测试中进行评估。因此测定的准确度和灵敏度对于识别活性化合物至关重要。z
’‑
factor的计算公式如下所示：
[0111][0112]
式中μ
+
和μ-分别代表阳性和阴性对照的平均偏振值，sd
+
和sd-分别是阳性对照和阴性对照的标准偏差。一般来说，高通量筛选中z
’‑
factor接近1是最理想的，z
’‑
factor在
0.5～1之间被认为质量较好，在0.5～0之间被认为质量中等或较差，z
’‑
factor小于0则说明不适用于高通量筛选。
[0113]
一个384黑色孔板上，22.5μl含有10nm his-fxr-lbd、1nm anti-his-tb和150nm的新型fxr荧光探针(化合物b)的混合液中加入终浓度为0.5mm ivermectin作为阳性对照，dmso作为阴性对照(加入等量dmso)，阳性对照和阴性对照的孔均为32个。将混合液室温孵育30分钟后用酶标仪读数，激发波长和发射波长分别为495nm和520nm。使用graphpad prism 8.0软件进行作图，按照z
’‑
factor的计算公式进行计算。测试结果如图7所示，计算所得z
’‑
factor为0.684，证明本实验采用化合物b的tr-fret竞争性结合实验方法可靠，可用于药物高通量筛选。
[0114]
效果实施例4采用tr-fret竞争性结合实验比较四种化合物与fxr的亲和能力、化合物b与dy246荧光探针的灵敏度
[0115]
第一步，一96孔板上每孔加入39.2μl含0.005％tween20的磷酸盐缓冲液(20mm phosphate buffer(磷酸盐缓冲液，kh2po4，k2hpo4)+50mm kcl+5mm tecp+0.5mm edta)；第二步，将浓度2mm的奥贝胆酸(oca)、cilofexor、nidufexor、伊维菌素(ivermectin)四种化合物按照1:3梯度稀释至第12个孔，加入到第一步的溶液混匀，每孔0.8μl；第三步，第一步的溶液每孔加入20μl 600nm新型fxr荧光探针(化合物b)或者dy246探针(化合物b或dy246探针的终浓度为150nm，dy246探针的合成方法参考文献：donna d.yu,wenwei lin,taosheng chen 2,and barry m.forman.development of time resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for fxr antagonist discovery.bioorg med chem.2013july 15；21(14):4266
–
4278.)混匀；第四步，第一步的溶液每孔加入20μl含40nm his-fxr-lbd(同效果实施例2)和4nm anti-his-tb(同效果实施例2)的混合溶液混匀；然后取75μl转移至384黑色孔板，每孔22.5μl，3个复孔。将混合液室温孵育30分钟后用酶标仪读数，激发波长和发射波长分别为495nm和520nm。使用graphpad prism 8.0软件进行作图，即可得到图8的520/495比值曲线图。四种化合物与fxr的亲和能力的结果如图8中a所示：化合物nidufexor曲线位于最左边，化合物ivermectin曲线图位于最右边，说明这四个化合物与fxr的亲和能力由高到低依次是nidufexor、cilofexor、oca、ivermectin；化合物a与dy246荧光探针的灵敏度的结果如图8中a、b所示：荧光探针浓度同为150nm时，新型fxr荧光探针(化合物b)的检测窗口明显高于文献报道的dy246荧光探针，说明新型fxr荧光探针(化合物b)的灵敏度高(以绝对表达值倍数变化表征灵敏度；化合物b与dy246的绝对表达值倍数变化约为8倍)。
[0116]
效果实施例5采用新型fxr荧光探针(化合物b)以tr-fret竞争性结合实验和传统tr-fret体系筛选商业化激素核受体化合物库(陶素，产品编号l1510)
[0117]
1)采用新型fxr荧光探针(化合物b)以tr-fret竞争性结合实验筛选商业化激素核受体化合物库(示意图如图1所示)
[0118]
一个384黑色孔板上，22.5μl含有10nm his-fxr-lbd、1nm anti-his-tb和150nm的新型fxr荧光探针(化合物b)的混合液中加入0.5μl 0.5mm的商业化激素核受体化合物库中的每个化合物。将混合液室温孵育30分钟后用酶标仪读数，激发波长和发射波长分别为495nm和520nm。使用graphpad prism 8.0软件进行作图，结果如图9中a所示，从图中可以看出，fxr的非活性配体的520/495比值位于阴性对照组dmso附近，而fxr的活性配体的520/
495比值位于阳性对照组附近，采用新型fxr荧光探针(化合物b)以tr-fret竞争性结合实验筛选出了16个fxr活性配体，与化合物库的描述一致，证实了采用新型fxr荧光探针(化合物b)以tr-fret竞争性结合实验的筛选体系的可靠性。
[0119]
2)以传统tr-fret体系筛选商业化激素核受体化合物库
[0120]
在一个384黑色孔板上，22.5μl含有10nm his-fxr-lbd、1nm anti-his-tb和400nm的共辅因子fitc-src2-2(序列为fitc-ahx-lkekhkilhrllqdsssp(seq id no.2)，购买于南京肽谷公司)的混合液中加入0.5μl 0.5mm的商业化激素核受体化合物库中的每个化合物。将混合液室温孵育30分钟后用酶标仪读数，激发波长和发射波长分别为495nm和520nm。使用graphpad prism 8.0软件进行作图，结果如图9中b所示，从图中可以看出，fxr的非活性配体的520/495比值位于阴性对照组dmso附近，而fxr的活性配体的520/495比值位于阳性对照组附近，此方法只筛选出了3个fxr活性配体，个数远远少于采用新型fxr荧光探针(化合物b)以tr-fret竞争性结合实验的筛选体系，说明了采用新型fxr荧光探针(化合物b)以tr-fret竞争性结合实验能够筛选出更多的fxr活性配体。
[0121]
效果实施例6采用tr-fret竞争性结合实验比较化合物b与cdca-f的灵敏度
[0122]
采用tr-fret竞争性结合实验比较化合物b与cdca-f(制备方法参考文献：identification of farnesoid x receptor modulators by a fluorescence polarization-based interaction assay)对his-fxr-lbd(同效果实施例2)的ec50值和激活效能，结果如图10及表1所示：化合物b(oca)的ec50和激活效能都远远低于cdca-f(cdca)，表明化合物b的灵敏度高于cdca-f。
[0123]
表1
[0124][0125]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。