通过电刺激的血小板的钙控制活化
[0001] 本技术是申请日为2016年12月29日，申请号为，发明名称为“通过电刺激的血小板的钙控制活化”的发明专利申请的分案申请。
[0002]
背景本文公开的主题一般涉及用于各种医学应用的血小板疗法，所述医学应用例如用于手术或创伤的治疗。某些实施方案涉及通过改变各种活化条件，包括但不限于脉冲电场的存在和特性以及钙的存在和浓度，进行血小板活化和凝血控制。
[0003]
血小板凝胶(也称为“富含活化血小板的血浆”)的使用是一种新兴的治疗方法，其可以在临床或其他健康护理设施中用于各种应用，包括促进伤口愈合(例如手术后)和止血。特别是，对于许多类型的损伤和病症，例如神经损伤、腱炎、骨关节炎、心肌损伤和骨修复和再生，存在对使用血小板疗法作为伤口愈合治疗的关注。另外，对患者使用的血小板凝胶的衍生可以是自体的，意味着血小板来自患者自身的组织和/或流体。因此，来自患者的血液样品可用于衍生用于治疗该患者的血小板凝胶。
[0004]
举例来说，医生可以从患者抽取血液。然后可以将血液离心以产生富血小板血浆(prp)。在血小板活化后，血液中的血小板释放有利于和促进伤口愈合级联的生长因子和蛋白质。因此，临床工作流程可包含从患者抽取血液，离心血液以分离出血小板，以及进行离体血小板活化，例如使用牛凝血酶。然后可将活化的血小板或血小板凝胶施用于伤口或其他治疗区域。在替代地使用体内血小板活化的情况下，医生可以在不添加血小板活化剂的情况下将prp应用于该部位。血小板活化，包括生长因子释放和凝血，通常由结缔组织内的胶原诱导。
[0005]
对于这样的离体应用，其中凝血酶(例如牛凝血酶)用于诱导血小板活化，所得的生长因子水平可以基于生物反应来固定。即，不同生长因子的量和/或各自的比例或比率由基于凝血酶的活化的性质决定。因此，在这样的反应中，临床医生不能调节或操纵不同生长因子的相应量或比率，而必须改为设法使用常规活化组合物。此外，在某些临床情况下，可能需要具有或不具有凝血和/或在凝血的存在下控制凝块的机械强度或其他特性。
[0006]
简要描述在一个实施方案中，提供了用于产生活化产物的方法。根据该方法，制备富血小板血浆(prp)样品用于活化。通过添加相应浓度的钙离子来制备prp样品。所述相应浓度的选择是基于凝块是否要存在于使用prp样品产生的活化产物组合物中，并且如果要存在凝血，则基于直至凝块形成的时间或凝块的机械强度中的一者或多者。prp样品相对于电磁刺激装置的电极放置。指定一组电脉冲参数。prp样品暴露于根据参数值产生的一个或多个电脉冲。当暴露于一个或多个电脉冲时，prp样品产生包含一种或多种生长因子并具有特定凝血特性的活化产物组合物。
[0007]
在另一个实施方案中，提供了用于产生活化产物的方法。根据该方法，制备抗凝血剂处理的富血小板血浆(prp)样品用于活化。将钙离子添加到prp样品中以获得选自可能浓度范围的钙离子浓度。基于使用prp样品产生的活化产物组合物中要存在的一种或多种生长因子的目标水平来选择浓度。prp样品暴露于电活化刺激。当暴露于电活化刺激时，prp样
品产生包含目标水平的一种或多种生长因子的活化产物组合物。在不改变电活化刺激的情况下改变钙离子浓度，使所述一种或多种生长因子的绝对或相对水平中的一者或两者变化。
[0008]
在另外的实施方案中，提供了用于控制血小板凝胶中的凝块机械强度的方法。根据该方法，确定要在血小板凝胶中产生的一个或多个凝块的预期的机械强度。预期的机械强度大于仅使用凝血酶产生血小板凝胶所观察到的机械强度。基于预期的机械强度，从多个钙离子浓度中选择对应于预期的机械强度的钙离子浓度。通过活化包含选择钙离子浓度的钙离子的富血小板血浆(prp)样品来产生血小板凝胶。使用电刺激活化prp样品。血小板凝胶包含凝块，该凝块一旦形成，具有预期的机械强度。
[0009]
附图的简要描述当参考附图阅读以下详细描述时，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，附图中相同的字符在整个附图中表示相同的部分，其中：图1是根据本公开的方面的脉冲产生系统的示意图；图2图示了根据本公开的方面的一组研究结果的初始凝块形成时间(凝血时间)；图3图示了根据本公开的方面的一组研究结果的凝块动力学；图4图示了根据本公开的方面的一组研究结果的纤维蛋白原水平；图5图示了根据本公开的方面的一组研究结果的凝块强度；图6描绘了代表性teg描绘，其描绘了根据本公开的方面的一个研究参与者随时间观察到的凝块机械强度(ma)；图7图示了根据本公开的方面的一组研究结果的pf4水平；图8图示了根据本公开的方面的一组研究结果的pdgf水平；图9图示了根据本公开的方面的一组研究结果的vegf水平；和图10图示了根据本公开的方面的一组研究结果的egf水平。
[0010]
详细描述下面将描述本主题的一个或多个具体实施方案。为了提供这些实施方案的简明描述，可能不在说明书中描述实际实施方案的所有特征。应当理解，在任何此类实际实施方案的开发中，如在任何工程或设计项目中，必须做出许多特定于实施方案的决定以实现开发者的特定目标，例如遵守与系统相关的和与业务相关的约束，可能因实施方案而异。此外，应该理解的是，这种开发工作可能是复杂且耗时的，但是对于受益于本公开的普通技术人员来说仍然是设计、制造和生产的常规任务。
[0011]
本文提出的技术被引用并应用于实用性质的实质对象和具体示例，确实改进了本技术领域，并且因此不是抽象的或纯理论的。
[0012]
当介绍本发明的各种实施方案的要素时，冠词“一”，“一个”，“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在是包含性的，并且意味着可能存在除所列要素之外的其他要素。
[0013]
血小板活化和/或聚集可用于体内和/或离体治疗伤口。对于体内血小板活化，未活化的富血小板血浆(prp)在损伤部位施用或注射，并由体内天然存在的化合物，例如结缔组织中存在的胶原活化。
[0014]
在常规离体方法中，将抽取和分离的血液中的血小板暴露于血小板活化化合物，
例如凝血酶，其诱导生长因子(例如，血小板衍生的生长因子(pdgf))的释放。例如，对于离体血小板活化，医生可以从患者抽取血液并离心血液样品以产生富血小板血浆(prp)样品。可以将钙离子源和血小板活化化合物(例如凝血酶)添加到prp样品中以触发血小板活化并形成含有生长因子的凝胶，然后将其施用于伤口。
[0015]
本文讨论的方法涉及在不同浓度的钙离子(ca
++
)存在下离体血小板(或其他细胞)活化和生长因子释放，钙离子(ca
++
)可以以盐的形式(例如，cacl2) (例如cacl2，以2.5mm至20mm的浓度范围提供，包括但不限于：2.5 mm、5.0 mm、7.5 mm、10 mm、15 mm、20 mm和25 mm)引入活化混合物中。添加的钙不应与样品中钙的最终浓度混淆。还应当理解，在某些实施方案中，其中加入钙的prp样品可包括已知量的抗凝血剂(例如acd-a)，其可以影响加入的钙量的确定。另外，活化混合物可以暴露于一个或多个可定制的能量暴露方案(例如，一个或多个电脉冲)。有或没有能量暴露的不同浓度的钙离子的存在可以根据本文讨论的某些实施方案用于控制或改变由血小板活化过程引起的凝块形成，并且在一些实施方案中，可以完全防止凝血。对于凝块形成的这种控制可用于在其中活化的血小板产物将局部施用的情况(可能需要凝血)，与其中可注射产物的应用相对(其中凝块将是不合适的)。另外，通过控制活化混合物中的钙离子浓度或能量暴露(例如，电的)参数中的一者或两者，可以实现改变凝块的机械强度，如本文所讨论的。举例来说，通过在活化过程中添加钙离子，如本文所讨论的，在活化的血小板产物中形成的凝块的所得机械强度大于单独基于凝血酶的活化中(即，没有添加钙离子)所见的。最后，如本文所讨论的，操控活化混合物中的钙离子浓度或能量暴露(例如，电的)参数中的一者或两者可用于控制、定制或优化所得活化血小板产物中一种或多种生长因子的释放或相对比率。
[0016]
因此，举例来说，如本文所讨论的离体血小板活化可包含在ca
++
离子存在下将血液样品(例如prp样品)或任何含有血小板的悬浮液(例如血小板悬浮液或全血)暴露于电脉冲(例如，暴露于脉冲电场)或其他合适的活化能以触发血小板活化。在某些实施方案中，可以使用不同的电参数(例如，幅度、电压、电场、能量密度、电流、脉冲宽度、脉冲数等)来施加电刺激或活化，用不同的参数或参数的组合以及指定浓度的ca
++
，以达到不同的生长因子水平和/或控制凝块形成的方面。结果，可以产生具有特定生长因子和凝血特性的活化组合物，相反，具有特定生长因子和/或凝血特性的活化组合物的产生可以确定在活化给定的细胞组合物中所采用的电脉冲参数和ca
++
浓度。
[0017]
如上所述，控制活化混合物中的ca
++
浓度是本文讨论的各种实施方案的基础。这些实施方案中的某些还可以利用脉冲电场作为活化方案的一部分。考虑到这一点，图1示意性地显示了脉冲产生系统10，用于使用适合于产生具有特定生长因子特征和凝血特性的组合物的ca
++
浓度的离体血小板活化。系统10包括脉冲产生电路12和相对的电极(或电极阵列)14和16。在所描绘的示例中，电极14和16在小池18的相对侧上间隔开。也就是说，小池18设置在电极之间，电极14和16通过触点20偶联到脉冲产生电路。也就是说，在所描绘的示例中示出了导电偶联(即，接触偶联)。然而，应该理解的是，提供该接触偶联示例仅仅是为了便于解释并提供用于解释本方法的有用背景，并且不是用于将样品(如本文所讨论的)暴露于活化能的唯一合适的机制。例如，在其他实施方案中，可以采用非接触偶联技术(例如电容或电感偶联技术)来实现所讨论的能量偶联。因此，如本文所讨论的，与血小板悬浮液的能量偶联应理解为通过任何合适的机制发生，无论是涉及样品容器与导管和电极之间的接触
(如本实施例中所示)，还是使用感应或电容效应而不存在这种接触。
[0018]
无论物理或结构实施方案如何，脉冲产生电路12在操作时，在小池18内ca
++
存在下电刺激或活化的血液、血液组分或血小板悬浮液样品22，以活化样品22内的在被活化或刺激时释放蛋白质和/或生长因子的血小板或其他细胞类型。如本文所讨论的，这可以采取这样的形式：当脉冲产生电路12工作时，将脉冲电场施加到小池18内包含的样品，而无论电极14和16与小池18物理结合或接合的方式如何。系统10可以配置成接受或容纳不同尺寸的小池，例如不同直径或宽度的小池。
[0019]
小池18可以是一次性的和/或可从包含电极14和16的样品支架24移除。将小池18插入样品支架24中并使电极14和16与触点20接触允许脉冲产生电路12产生跨越样品22的电脉冲。将会理解，小池18仅仅是合适的样品容器的一个例子，且配置成容纳样品22，与电极14和16接触，以及传导电脉冲的其他类型的容器可以与系统10结合使用。如本文所讨论的，电极14和16之间的间隔可以影响脉冲电场的强度，其被定义为施加电压和小池间隙距离的比率。例如，将1cm宽的小池暴露于1kv脉冲，产生1kv/cm的场强。如本文所讨论的，场强、电极间隔距离和与产生的电脉冲相关的其他参数是可以被改变或调整的因素，以在活化过程期间改变相对于彼此的生长因子水平。
[0020]
可以理解，所描绘的基于小池或容器的活化系统适用于分批型处理环境。然而，可以替代地采用流通型处理环境，其中代之以导管穿过电极14和16，电极14和16可以位于导管的相对侧上或围绕导管。这种流通设置允许样品连续地流过导管以暴露于脉冲电场以进行活化，其中活化产物以连续或半连续方式收集。除了或代替电极处的电参数和/或电极14和16之间的宽度，还可以调整其他参数以配置活化过程。例如，通过导管的样品(例如，血小板悬浮液)的流速和/或导管的直径也可以被认为是活化过程的因素或参数或者作为活化过程的因素或参数来调整。也就是说，除了为电极指定的电参数之外，流速和电极间距中的一者或两者可以确定样品在活化期间经历的电场暴露(或场密度暴露)。
[0021]
该系统可以包括控制和输入电路，并且可以在专用外壳中实施，或者可以偶联到计算机或其他基于处理器的控制系统。例如，系统10可以包括或与控制脉冲产生电路12的处理器26通信。系统10的附加组件可以包括存储器28，存储器28存储由处理器26执行的指令。这些指令可以包括用于使用脉冲产生电路12产生电脉冲的方案和/或参数。处理器26可以包括例如通用目的的单芯片或多芯片微处理器。另外，处理器26可以是任何常规的专用目的处理器，例如专属应用的处理器或电路。存储器28可以是任何合适的非暂时性计算机可读介质，诸如随机存取存储器、大容量存储设备、固态存储器设备或可移动存储器。另外，显示器30可以向操作员提供与系统10的操作有关的指示。系统10可以包括用户输入设备32 (例如，键盘、鼠标、触摸屏、跟踪球、诸如pda或智能电话的手持设备或其任何组合)，用于激活脉冲产生电路12，选择或指定适当的脉冲参数或者从多个这样的特征(例如，各自对应于不同的活化产物组合物或特性的特征(例如，生长因子特征、凝块强度、凝血的存在或不存在等)中选择预配置的脉冲特征。
[0022]
如本文所讨论的脉冲产生系统10可以实施为用于血小板或其他细胞类型活化的单用途设备，或者可以用于其他电场暴露应用(例如电穿孔，通过暴露于电刺激加速细胞生长，以及血小板(或其他细胞类型)活化)的多用途设备。此外，系统10可以被配置为根据一个或多个定义的方案和/或使用一个或多个参数来产生电脉冲，所述参数可以被改变以产
生具有不同特性的活化产物。关于各种电脉冲因素或参数，这些因素包括但不限于：小池间距(即，施加脉冲所跨越的小池18的宽度)、流速(在流通实施方案中)、电压、电场(例如，强度或密度)、电流、脉冲宽度、脉冲持续时间和施加的脉冲数。
[0023]
方案可以由用户输入产生和/或可以存储在存储器28中以由用户选择，例如从列表或菜单中选择。脉冲产生电路12可以在处理器26的控制下操作，以实施使用指定的电场强度、ca
++
浓度、脉冲长度、总暴露时间、流速(用于流通实施方案)或其他特性的方案，以产生定制的活化细胞组合物。这样的方案可以通过经验或理论研究来确定，例如以对应于期望的临床用途。在其他实施方案中，系统10可以被配置为接收与电场强度、ca
++
浓度、脉冲长度、流速和/或总暴露时间中的一个或多个相关的用户输入，即用户可以改变或指定这些操作参数中的一个或多个。此外，系统10可以被配置为根据用户输入和/或存储的方案设置产生特定脉冲形状或产生可以彼此不同的一系列脉冲。
[0024]
举例来说，取决于应用，由系统10产生的脉冲可具有约1纳秒至约100微秒的持续时间，以及约0.1kv/cm至约350kv/cm的电场强度。如上所述，脉冲的电场强度是施加的电压除以电极14和16之间的距离。虽然系统10产生的脉冲通常具有0.1kv/cm或更高的电场强度，但脉冲通常不会超过包括细胞的悬浮液的击穿场。
[0025]
脉冲产生系统10还可以包括感测功能。也就是说，脉冲产生系统10可以被配置为将样品22暴露于感测信号，感测信号可以是电场强度低于用于细胞活化的电脉冲的电场强度的电脉冲。脉冲产生系统10可以如图1所示，包括电流感测电路34，其可以获取和/或处理感测信号以估计样品22的一些电学或化学性质，包括但不限于导电性和介电常数。实际上，这种感测电路可用于确定被处理样品中的cl
++
浓度，以确认ca
++
浓度符合选择的方案和/或基于观察到的或测量的样品中存在的ca
++
浓度调整操作参数。
[0026]
电流感测电路34可以偶联到处理器26，处理器26可以控制感测信号的产生和处理，并且可以执行处理的一部分。在其他实施方案中，电流感测电路34可以包括专用处理器以控制感测信号的处理，并且可以与处理器26通信以报告结果。或者，电流感测电路34可以与脉冲产生电路12结合在一起，提供用于产生后续活化电脉冲的输入。在其他实施方案中，感测信号的处理可以由如上所述的专用处理器或处理器26执行。
[0027]
研究设计-在一项研究中，这些参数的组合与其他控制或活化方案一起进行测试。在该研究中，制备浓缩的富血小板血浆(prp)用于该研究。供血者如果18岁或以上，未服用阿司匹林或其他抗血小板药物10天或更长时间，并且未服用所有其他非甾体类抗炎药物3天或更长时间，则有资格参加。在丢弃2ml后，从5个志愿供血者中的每一个收集120ml血液到1/10体积的酸-柠檬酸盐-葡萄糖溶液a(acd-a)中。prp根据制造商的推荐使用具有两个60ml筒(cartridges)的harvest smartprep2系统(harvest technologies, plymouth, ma, usa)制备。在进一步处理之前合并所得的prp。在sysmex xn血液学分析仪中对acd抗凝的全血和浓缩的prp进行全血细胞计数。
[0028]
然后使用两个脉冲电场(pef)之一，即pef a或pef b，或在牛凝血酶(1u/ml终浓度，biopharm laboratories llc, bluffdale, ut, usa)存在下活化制备的prp。在用pef或凝血酶活化之前，通过加入1/100体积的cacl2(2.5mm或20mm终浓度，bachem, torrance, ca, usa)使prp样品再钙化。在相应于关于图1所述的系统中，在2mm电穿孔小池((molecular bioproducts, san diego, ca, usa)中在每种条件下处理总共2ml浓缩的
prp。pef a的参数如下：一个脉冲；脉冲宽度约为5微秒，电压幅度为~3.3 kv，电流超过300a。pef b的参数如下：120个双极脉冲，每秒1个脉冲，~800v(电压)和~70a(电流)。对照包括仅用仅具有高cacl2(即，20mm水平的添加的cacl2)的缓冲液(盐水)，和用具有低(2.5mm)和高(20mm)添加的cacl2的凝血酶处理的prp。
[0029]
表1总结了研究参数的各种组合。
[0030]
表1测量的端点包括：(1)通过凝血弹性描记法(teg)和凝血酶原片段f1.2产生测量的凝块形成动力学和强度，(2)通过流式细胞术测量的α颗粒(p-选择蛋白)和t-颗粒(toll样受体9(tlr9)，蛋白质二硫键异构酶(pdi))标记物的血小板表面表达，(3)从血小板释放到上清液中的因子(egf、pdgf、vegf、pf4、pdi)。在活化后15分钟取样的样品中测量除teg外的所有端点。
[0031]
凝血弹性描记法和血浆凝血酶原的活化-为了分析活化产物(即血小板凝胶)中的凝块形成，将360μl活化的prp转移至teg杯并在prp暴露于活化条件后立即开始记录。使用teg 5000止血分析仪系统(haemonetics corporation, braintree, ma, usa)获得测量值。监测凝血动力学和特性30分钟。
[0032]
为了确定钙、pef、凝血酶和对照条件促使血浆凝血酶原转化为活性凝血酶的程度，将样品离心，回收上清液，并通过elisa(enzygnost, siemens, marburg, germany)根据经销商手册测量在prp活化后15分钟收集的上清液中的f1.2。
[0033]
血小板α颗粒和t-颗粒释放-在prp活化后，将每个样品的一部分与肽gly-pro-arg-pro (gprp)混合，其防止纤维蛋白聚合成凝块，从而允许通过流式细胞术对血小板表面标记物进行流式细胞术分析。特别地，流式细胞术用于评估血小板颗粒的差异释放和颗粒含量，如通过血小板表面p-选择蛋白(cd62p)(对于α颗粒)和血小板表面pdi和tlr9(对于t-颗粒)的变化所测量的。通过加入等体积的2%甲醛/10 mm hepes, 0.15 m nacl, ph7.4，在活化后，将用于流式细胞术的样品固定15分钟。样品在hepes-盐水缓冲液(10 mm hepes, 0.15 m nacl, ph 7.4; 来自sigma, st. louis, mo, usa的化学品)中稀释12倍，然后加入到fitc缀合的抗tlr9(克隆5g5, abcam, cambridge, ma, usa)、藻红蛋白(pe)-缀合的p-选择蛋白(克隆ak4，bd pharmingen, san diego, ca, usa)和cd41-percp-cy5.5 (克隆hip8, bd pharmingen, san diego, ca, usa)的混合物中，或fitc-缀合的抗-p-选择蛋白(克隆ak4, bd pharmingen, san diego, ca, usa)、pe-缀合的pdi(克隆1d3，abcam，cambridge，ma，usa)和cd41-percp-cy5.5的混合物中。使用与同种型匹配的fitc、同种型匹
配的pe和percp-cy5.5-缀合的正常ig的混合物反应的样品平行测定非特异性染色。在室温下染色30分钟后，加入400μl的1%甲醛/ hepes-盐水缓冲液。在校准的becton dickinson facscalibur中进行流式细胞术分析。
[0034]
通过用elisa(cloud-clone corp., houston, tx, usa)根据经销商手册在prp活化后15分钟收集的上清液中测量pdi进一步评价t-颗粒释放。
[0035]
血小板颗粒和生长因子的差异释放-使用市售的elisa试剂盒(egf和pdgf r&d系统, minneapolis, mn, usa; vegf, eagle biosciences, nashua, nh, usa; pf4, abcam, cambridge, uk)测量处理的prp上清液中的表皮生长因子(egf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)和血小板因子4(pf4)的水平。
[0036]
分析-使用graphpad prism版本5.0a (graphpad software, la jolla, ca, usa)分析观察到的数据。正态分布的数据(通过d’agostino和pearson综合正态性检验判断)总结为平均值
±
标准偏差或平均值
±
平均值的标准误差，如所示。非参数数据报告为中位数和四分位数范围或中位数和范围。单因素方差分析用于比较三个或更多组，tukey多重测试后比较用于个体比较。
[0037]
结果-凝块动力学和强度(teg和凝血酶产生)-通过凝血弹性描记法测量的脉冲电场(pef)条件和相对于牛凝血酶的钙水平关于凝血动力学和凝块强度的比较示于表2中。
[0038]
表2*p《0.05vs.凝血酶，20mm cacl2;关于teg结果，对于各研究因素，初始凝块形成的时间r在图2中图示。具体地，teg r代表凝血的酶促部分，并且是从血液放置于teg分析仪中的时间直到初始纤维蛋白形成的潜伏期(以分钟为单位)。teg k是达到预定水平的凝块强度所需的时间并且代表凝块动力学(图3中图示)。teg角度是由于纤维蛋白积聚和交联的快速性而随时间的幅度变化的斜率，以度为单位，并且表示纤维蛋白原水平(图4中图示)。teg最大幅度(ma)(图5中图示)是以毫米为单位的最大幅度，并且是纤维蛋白和血小板结合的最大动态性质和纤维蛋白凝块的最终强度的直接函数。teg ma被认为代表血小板功能和/或聚集。在图2-4的每个图中，绘制了单独的结果，以及平均值和平均值的标准误差(sem)。
[0039]
如表2所示(并且在图2中图示)，凝血酶处理的样品(运行5和6)的初始凝块形成时间最短，在不到一分钟内发生，相反，运行3(pef a, 20 mm cacl2)在约4分钟时开始凝血，
运行4(pef b, 20 mm cacl2)在约9分钟时开始凝血，并且单独的高钙(运行8)在约13分钟时开始凝块。在运行1(pef a, 2.5 mm cacl2)、运行2(pef b, 2.5 mm cacl2)或运行7(即用缓冲液(无钙)处理)中活化后最多30分钟通过teg未检测到凝块，这在表2中未显示。
[0040]
这些结果与凝血酶产生结果一致，其中观察到单独用高钙培养的prp的最高水平的f1.2(运行8)，而对于无钙对照(运行7)和运行1和2两者(pef a, 2.5 mm cacl2和pef b, 2.5 mm cacl2)检测不到f1.2。这与teg研究的结果一致，teg研究显示在没有钙的情况下(运行7)或在用pef a, 2.5 mm cacl2和pef b, 2.5 mm cacl
2 (运行1和2)处理30分钟后没有可检测到的凝血。
[0041]
因此，如这些结果所示，所测试的脉冲电场均未产生在低ca
++
(2.5 mm cacl2)情况下凝血的活化产物。在其他情况下，凝血时间基于活化方法而变化，pef a和高ca
++
(20 mm cacl2)在~4分钟内凝血，pef b和高ca
++
在~8分钟内凝血，在高或低ca
++
存在下的凝血酶在~1分钟内凝血。可以理解，其意义在于，ca
++
水平与活化方法相结合，可以用于控制到底是否发生凝血，并且如果确实发生凝血，控制初始凝块形成的时间(例如，凝血的时间)。
[0042]
尽管花费更多时间才出现初始凝块形成，但凝块强度(ma)(图5中显示)在运行4(pef b, 20 mm cacl2)和单独的钙对照(运行8)中最高。对于运行6(凝血酶，20 mm cacl2)和运行3(pef a, 20 mm cacl2)，凝块强度(ma)是相似的，尽管运行3的凝块强度似乎更可变。通常，在活化过程中添加钙离子产生具有凝块的产物，所述凝块的机械强度大于仅使用凝血酶而不添加钙的活化过程中所见的。作为另一个例子，图6描绘了代表性teg描记，其描绘了对于一名志愿者随时间观察到的凝块机械强度(ma)。
[0043]
关于这些结果，总之，acd-抗凝血的prp用20 mm cacl2再钙化导致估计的游离ca
++
浓度为5mm(基于柠檬酸盐和钙离子之间的总结合常数计算)，并且导致如通过f1.2的产生所证明的凝血酶的产生和凝块的形成，所述凝块的强度(弹性模量，源自teg最大幅度)大于直接加入凝血酶后形成的凝块的强度。在用20 mm cacl2再钙化prp后立即加入pef a或pef b处理缩短了引发凝血所需的时间，并且仍然产生与凝血酶, 20 mm cacl2产生的凝块相比一样强(pef a, 20 mm cacl2)或更强(pef b, 20 mm cacl2)的凝块。因此，用20 mm cacl2和pef a和pef b形成的血小板凝胶的强度允许操控材料并放置在伤口上的适当位置。当用pef a或pef b刺激用2.5 mm cacl
2 (估计90
ꢀµ
m游离ca
++
)补充的prp时，凝块未能形成，使得这些条件不适于制备用于伤口愈合的血小板凝胶，但允许容易地分离释放的因子。
[0044]
关于这些结果的凝血酶产生方面，与具有低钙或高钙的凝血酶相比，仅在高钙存在下更高水平的f1.2的当前结果表明，没有凝血酶的情况下添加钙有利于因子xa(参与来自凝血酶原的凝血酶活化)的产生，这可能是通过组织因子途径。pef a和pef b在高钙存在下产生的f1.2水平高于直接添加牛凝血酶产生的水平，但低于单独使用高钙产生的水平，这表明钙介导的因子xa的产生在存在pef a和b时效率较低，但大于在低钙或高钙和凝血酶存在下产生的因子xa。
[0045]
血小板α颗粒和t颗粒标记物的差异暴露-该部分研究的结果显示在表3和4中。
[0046]
表3
*p《0.05，相对于凝血酶，20 mm cacl2;
ꢀ†ꢀ
p《0.05，相对于盐水。
[0047]
在该研究的血小板α颗粒和t颗粒标记物部分中，如表3所示，在运行5和6(具有2.5mm或20 mm cacl2的凝血酶)以及在运行1和3(即，pef a, 2.5mm，或pefa, 20 mm cacl2)中大于80%的血小板对于p-选择蛋白(血小板α颗粒膜蛋白)是阳性的，而在运行4(pef b, 20 mm cacl2)中较低百分比(53.5
ꢀ±ꢀ
33, 平均值
ꢀ±ꢀ
sd)的血小板为p-选择蛋白阳性的。与运行2(pef b, 2.5 mm cacl2)和无钙对照(运行7)相比，单独的高钙(运行8)引起p-选择蛋白阳性血小板百分比的适度增加。用pef处理的每个颗粒的p-选择蛋白的平均荧光强度(mfi)低于用凝血酶和低或高cacl2观察到的平均荧光强度(mfi)。
[0048]
血小板表面toll样受体9(tlr9)在运行5(凝血酶, 2.5 mm cacl2)中最高。对于运行4(pef b, 20 mm cacl2)观察到较低的tlr9和高度可变的tlr9水平，并且对于运行1和3(pef a, 2.5 mm cacl2和pef a, 20 mm cacl2)、运行2(pef b, 2.5 mm cacl2)和无钙和仅高钙对照(运行7和8)观察到可忽略的tlr9表达。总体而言，虽然tlr9的水平低于p-选择蛋白，但tlr9表达的模式与对p-选择蛋白观察到的表达模式没有明显不同。相反，pdi表达的模式是独特的，因为在运行6(凝血酶, 20 mm cacl2)而不是运行5(凝血酶, 2.5 mm cacl2)中观察到最高水平。
[0049]
参见表4，还通过用elisa测量的向经处理的prp样品的上清液中释放pdi来估计t颗粒释放。在运行1的上清液中pdi水平最高，其中prp用pef a和2.5 mm cacl2活化，而用凝血酶处理的样品(运行5和6)的水平接近或低于测定的检测限。这与在运行6(凝血酶, 20 mm cacl2)中最高的通过流式细胞术测量的血小板表面pdi不同。因此，就游离的pdi相对于表面结合的pdi而言，活化条件之间似乎存在差异。有趣的是，可溶性pdi水平与释放的egf水平最佳相关(r = 0.566, p = 0.0001)。
cacl2) ≈运行1(pef a, 2.5 mm cacl2)》运行2(pef a, 20 mm cacl2)》运行8(仅20 mm cacl2)》运行2(pef b, 2.5 mm cacl2) ≈没有钙。这些相对关系在图7、8和9中图示。在图7、8和9每一个中(以及下面讨论的图10中)，绘制各个结果以及平均值和sem。低于测定的检测限的结果绘制在检测的下限。
[0055]
相反，产生最多至最少释放的egf的条件是：运行1(pef a, 2.5 mm cacl2)》》运行3(pef a, 20 mm cacl2)》》运行6(凝血酶，20 mm cacl2)》运行5(凝血酶，2.5 mm cacl2)≈运行4(pef b, 20 mm cacl2)≈运行8(仅高钙)》运行2(pef b, 2.5 mm cacl2)≈运行7(无钙)。这些结果在图10中图示。因此，pf4、pdgf和vegf的水平彼此高度相关，而egf水平与pf4、pdgf和vegf无关，如表6所示，作为具有相应系数(r)(顶数)和相关概率(p值)(底数)的生长因子相关矩阵。
[0056]
表6关于这些结果，总之，尽管pef a, 2.5 mm cacl2没有产生凝块，但确实导致p-选择蛋白阳性血小板百分比显著增加，以及pdi、pf4、pdgf、vegf的显著释放，以及所有测试条件下释放的egf的最高水平。相反，pef b, 2.5 mm cacl2没有导致与缓冲液相比在p-选择蛋白、tlr9、pdi或任何生长因子方面的显著增加。在补充有20 mm cacl2的prp中，pef a和pef b均增加了α颗粒标记物p-选择蛋白的暴露，其程度大于单独的20 mm cacl2，但小于凝血酶, 20 mm cacl2。pf4、pdgf和vegf的水平(但非egf)与血小板α颗粒释放相关，如血小板表面p-选择蛋白表达(mfi)所示，并与t-颗粒释放相关，如血小板表面tlr9所示，而egf水平(但非pf4、pdgf或vegf)与活化后上清液中存在的pdi水平相关。因此，egf释放的模式不同于pf4、pdgf和vegf的释放模式，表明血小板内egf的分布也不同于这些其他因子的分布。释放的可溶性pdi与可溶性egf之间相关性的潜在解释包括在选择的血小板颗粒中的共定位或在不同颗粒中的定位，其释放由类似的刺激触发。鉴于egf对伤口愈合的上皮形成阶段很重要，pef a增强的egf释放在临床情况下可能是有用的。
[0057]
考虑到上述情况，可以产生活化的血小板产物，该产物不仅关于存在的生长因子及其相对比例，还针对凝血的存在与否和/或凝块形成的时刻来定制。也就是说，鉴于本文所述的凝血结果，可以理解凝血的存在或凝块形成开始的时间可以与生长因子释放相结合进行优化。例如，pef a和pef b结合高ca
++ (20 mm cacl2)导致所有测试的生长因子释放高于对照，尽管具有不同的相对比例。另外，如上述结果所示，pef a与低ca
++ (2.5 cacl2)结合产生不凝血但是所有测试的生长因子都被释放的活化产物。相反，pef b与低ca
++
结合产生不凝血并且测试的生长因子不被明显释放的活化产物。因此，可以使用电刺激和添加的
ca的适当组合来控制和/或调节释放的生长因子的水平和凝血时间；当不需要凝血时，可以使用电刺激和添加的ca的适当组合将生长因子以所需水平释放-高释放或低释放。
[0058]
综合和额外的ca和电条件结果-为了进一步支持前面的讨论和结果，显示了一系列电条件和钙离子浓度以及观察到的凝血时间、凝血强度、生长因子释放和溶血的另外的数据集显示于表7。如该另外的实例所示，钙离子浓度和电参数可以共同变化以获得沿不同的关注的轴的一系列响应(例如，凝块时间、凝块强度、释放的生长因子(对于多个、可独立操控的生长因子)、溶血等)。以这种方式，可以通过适当地选择钙离子浓度和/或一个或多个电脉冲参数中的一者或两者来配置活化产物的多个属性。
[0059]
作为表7中的实例，样品2、3、4和5具有相同类型的电刺激，但具有不同水平的添加钙。凝血时间可以根据添加的ca而从10.2分钟到17.4分钟变化；对于一个ca浓度，没有凝血。这提供了通过简单地调节ca浓度控制凝血/不凝血以及进一步控制这些样品的实际凝血时间的方式。当增加添加的ca的水平时，这些样品2、3、4和5释放的egf水平增加，提供了通过调节ca水平，同时在这种情况下保持相同类型的电刺激以调节释放的生长因子的方式。以类似的方式，可以调节溶血水平。
[0060]
因此，如表7所示，各种不同的电性质和脉冲参数可以与钙离子浓度一起变化，以实现各种不同的凝血时间和强度，同时仍然控制生长因子释放和溶血的单独水平。
[0061]
本发明的技术效果包括产生活化的血小板产物，其中凝块存在或不存在，凝块形成(如果存在)的时刻和/或凝块(如果存在)的机械强度中的一者或多者由在活化过程中钙离子的存在或浓度控制。作为活化过程的一部分，在脉冲电场或化学活化剂(例如凝血酶)存在下控制或指定钙离子浓度。
[0062]
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[0063]
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