一种提高欧洲牡蛎溶菌酶产量的方法与流程

本发明涉及一种提高欧洲牡蛎溶菌酶产量的方法，属于生物工程领域。

背景技术：

1、溶菌酶(lysozymes，lyzs)是一种胞壁质水解酶，能够断裂细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽。由于具有杀菌活性，lyzs在医药、生工、食品领域有重要应用价值。例如lyzs有抗菌、抗病毒和加快组织恢复功能，医学上常用溶菌酶含片治疗口腔溃疡和急慢性咽炎等疾病；lyzs有专性水解细胞壁的特点，生工领域常用溶菌酶来制备原生质体，提取和制造酶、核酸和活性多肽；lyzs能杀死肠道腐败球菌，促进婴儿肠道双歧乳酸杆菌增殖，是婴儿食品、饮料的良好添加剂。根据氨基酸序列和来源的差异，lyzs可分为：c型溶菌酶(鸡型溶菌酶)、g型溶菌酶(鹅型溶菌酶)、i型溶菌酶(无脊椎动物溶菌酶)和p型溶菌酶(噬菌体溶菌酶)。

2、目前，鸡蛋溶菌酶是商业溶菌酶的主要来源，其提取方法是结晶法。鸡蛋溶菌酶的等电点为10.7，向其中添加5％nacl盐溶液，可以改变溶液ph值，从而利用蛋白质等电点沉降的原理使鸡蛋溶菌酶结晶沉淀，达到分离纯化目的。这种方法虽然操作简单，但耗时过长，通常要一周才能获得高纯度溶菌酶；回收率较低，仅能回收60-80％；原料受限，结晶过程中杂蛋白的去除不完全。

3、利用基因工程技术，异源生产溶菌酶，能从根本上解决溶菌酶的原料受限问题。有报道将人源溶菌酶基因转入动物体内如山羊、奶牛和小鼠，通过乳腺分泌的方式在乳汁中获得了溶菌酶蛋白，但该方法操作繁琐，纯化工作也相对复杂。微生物法生产溶菌酶既方便快捷，又不需要消耗大量原料，只需为微生物提供充足的营养成分，使溶菌酶基因在宿主细胞中表达形成蛋白质，通过简便的分离纯化既可得到纯度较高的溶菌酶。由于溶菌酶分子内经常含有二硫键，因此在大肠杆菌等原核宿主中的表达并不理想，表达体系更为完善的真核细胞是生产溶菌酶的更佳选择。毕赤酵母pichia pastoris gs115具有生长速度快、遗传操作简单、分泌效率高、对外源蛋白进行糖基化修饰的优点，是实现重组酶高水平分泌表达的常用真核表达系统。如masuda等利用毕赤酵母细胞异源表达鸡蛋溶菌酶，产量达400μg/ml；ercan等利用酵母作为宿主菌株表达人源溶菌酶，产量达到187u/ml。

4、目前，鸡蛋溶菌酶和人源溶菌酶已在酵母细胞中实现了异源表达，但仍存在活性不高、产量偏低的问题，不能满足工业对溶菌酶的大量需求。因此，筛选高活性且热稳定性好的溶菌酶目标基因，并实现其在毕赤酵母中的高效表达是亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种牡蛎来源的溶菌酶，具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。

2、本发明还提供了编码所述溶菌酶的基因。

3、在一种实施方式中，所述基因具有seq id no.2所示的核苷酸序列。

4、本发明还提供了表达所述溶菌酶的重组毕赤酵母。

5、在一种实施方式中，所述毕赤酵母以毕赤酵母gs115为宿主。

6、在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以ppic9k为表达载体。

7、在一种实施方式中，所述溶菌酶的n端(第一个氨基酸前)融合有短肽h6、k6、r6、d6、e6、n6、q6，或蛋白标签ap2、flag、hl28、sumo或strep。

8、本发明还提供了一种提高溶菌酶表达量的方法，所述方法在所述溶菌酶氨基酸序列的n端融合短肽h6、k6、r6、d6、e6、n6、q6，或蛋白标签ap2、flag、hl28、sumo或strep。

9、在一种实施方式中，所述短肽h6、k6、r6、d6、e6、n6、q6的氨基酸序列分别为hhhhhh、kkkkkk、rrrrrr、dddddd、eeeeee、nnnnnn、qqqqqq；所述ap2、flag、hl28、sumo或strep的氨基酸序列分别如seq id no.14～18所示。

10、本发明还提供了一种生产牡蛎来源溶菌酶的方法，所述方法是将所述重组毕赤酵母在培养基中培养一段时间，收集细胞培养液中的溶菌酶。

11、在一种实施方式中，所述培养基为bmmy培养基。

12、在一种实施方式中，所述培养是在于28～30℃、150～200rpm培养至少96h。

13、本发明还要求保护所述溶菌酶、所述毕赤酵母或所述方法在生产含溶菌酶的产品中的应用。

14、本发明还要求保护所述所述溶菌酶在细胞裂解方面的应用。

15、有益效果：

16、本发明从脊椎动物、软体动物、禽类和昆虫共12种不同来源溶菌酶基因序列中筛选获得了酶活相对较高且具有良好的热稳定性的欧洲牡蛎来源溶菌酶(oelyz)，并实现酶在毕赤酵母中的活性表达；

17、本发明还通过在oelyz的n端融合不同氨基酸短肽和蛋白标签，当融合sumo标签时，摇瓶水平上重组oelyz的胞外酶活达到382.6u/ml，此产量水平可以满足溶菌酶在医药、生工、食品领域的应用需求。

技术特征：

1.编码溶菌酶的基因，其特征在于，含有seq id no.2所示的核苷酸序列。

2.溶菌酶融合蛋白，其特征在于，在溶菌酶的n端融合有短肽h6、k6、r6、d6、e6、n6或q6，或蛋白标签ap2、flag、hl28、sumo或strep；所述溶菌酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求2所述的溶菌酶融合蛋白，其特征在于，蛋白标签ap2、flag、hl28、sumo、strep的氨基酸序列如seq id no.14～18所示。

4.重组微生物，其特征在于，表达seq id no.2所示的溶菌酶，或表达权利要求2～3任一所述的溶菌酶融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，以毕赤酵母为宿主。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，以ppic9k为表达载体。

7.一种提高溶菌酶表达量的方法，其特征在于，在seq id no.2所示溶菌酶氨基酸序列的n端融合短肽h6、k6、r6、d6、e6、n6或q6，或蛋白标签ap2、flag、hl28、sumo或strep。

8.一种生产牡蛎来源溶菌酶的方法，其特征在于，将权利要求4～5任一所述的重组微生物在培养基中培养一段时间，收集细胞培养液中的溶菌酶。

9.氨基酸序列如seq id no.2所示的溶菌酶、权利要求2～3任一所述的溶菌酶融合蛋白、权利要求4～6任一所述的重组微生物、权利要求7～8任一所述的方法在生产含溶菌酶的产品中的应用。

10.权利要求2～3任一所述的溶菌酶融合蛋白在细胞裂解方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种提高欧洲牡蛎溶菌酶产量的方法，属于生物工程领域。本发明从脊椎动物、软体动物、禽类和昆虫共12种不同来源溶菌酶基因序列中筛选获得了酶活相对较高的欧洲牡蛎来源溶菌酶，并实现酶在毕赤酵母中的活性表达。本发明还通过在OElyz的N端融合不同氨基酸短肽和蛋白标签。当融合Sumo标签时，摇瓶水平上重组OElyz的胞外酶活达到382.6U/mL，此产量水平可以满足溶菌酶在医药、生工、食品领域的应用需求。

技术研发人员：康振,庞博,邱银华,王新敬,王阳,堵国成
受保护的技术使用者：美药星(南京)制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12