一种降低大米淀粉GI值的方法及其应用

一种降低大米淀粉gi值的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及食品酶工程领域，具体的说，尤其是涉及一种糖原分支酶突变体及其在降低大米淀粉gi值的方法及其应用。


背景技术：

2.大米(稻米)是我国重要的谷类作物，其不仅作为人民百姓的主要粮食作物，同时还可以作为酿酒、糖浆、米粉米线、大米膨化食品等下游产品的加工原料。大米中最丰富的成分就是大米淀粉。然而近年来随着人均收入水平的增加，人们的膳食结构发生了很大变化，消费者对于健康饮食的需求日渐增长，有关研究指出，大米淀粉的过量摄入会引起高血糖负荷和其他潜在疾病风险。
3.gi的全称为glycemic index，意为“食物血糖生成指数”，简称“升糖指数”。它是反映食物引起人体血糖升高程度及人体进食后机体血糖生成应答状况的指标。低gi食物可以延长在人体内消化和吸收时间，为人体提供稳定和持续的能量供应，辅助稳定血糖水平，平缓糖尿病患者的血糖变动曲线，改善血压及降低体内脂肪累积。
4.抗性淀粉是一种难以被小肠消化，但能被结肠内的肠道菌群发酵成短链脂肪酸的一类淀粉。若能将大米淀粉改性成为抗性大米淀粉则能减少消费者的血糖代谢负担。因此，大米抗性淀粉制备工艺的开发与普及应用对提高全民健康膳食具有非常重要的意义。
5.目前，制备抗性淀粉的方法主要有三种，分别为物理改性、化学改性和酶法改性。其中，物理改性与化学改性均存在副产物多、生产效率低以及安全性差等问题，而酶法相比较物理、化学的方法对于反应的条件更加温和，产物更加安全受到本领域的重点关注。
6.酶法改性主要是通过使用麦芽糖淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉蔗糖酶和/或葡萄糖基转移酶等酶对淀粉进行处理，将分子量大的淀粉切割成较小的分子或增加淀粉分子内如α-1,6键、α-1,3键等的抗消化的化学键以降低淀粉的消化率。但是，由于现有的麦芽糖淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉蔗糖酶和/或葡萄糖基转移酶等酶切割淀粉以及在淀粉内生成抗消化化学键的效率过低，使用酶法改性制备抗性淀粉时具备生产效率低的问题。因此，仍需找到一种高效的酶改性手段以提高抗性淀粉的生产效率。现有技术中还缺少高效的改性酶。目前寻找更加高效的改性酶的方法是自自然环境中筛选获得新的可以降低淀粉gi指数的酶，或者是在已知的酶基础上进行突变筛选，获得更加高效的酶。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种降低大米淀粉gi值的方法。本发明以糖原分支酶vvgbe为基础，进行突变筛选，获得适用于大米淀粉改性的糖原分支酶。并优化糖原分支酶的活性条件，确定低gi大米淀粉生产工艺。
8.为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
9.本发明提供一种糖原分支酶突变体，其特征在于，所述的突变体是以seq id no:1为出发酶，在其f224,w316,y410至少一处位置引入突变获得；在一个具体的实施例中，所述
的突变体在f224引入突变，优选的所述的突变为f224g；在另外一个具体的实施例中，所述的突变体在f224,w316处引入突变，优选的，所述的突变为f224g/w316a；在另外一个具体的实施例中，所述的突变体在f224,w316，y410处引入突变，优选的，所述的突变体为f224g/w316a/y410p。
10.本发明的第二个方面是提供一种编码第一方面所述酶突变体的核酸。
11.本发明的第三个方面是提供含有第二方面所述核酸分子的表达盒、载体，优选的，所述的载体为质粒；更有选的，所述的载体为在原核细胞中表达的质粒，最优选的，所述的质粒为pet-28a(+)。
12.本发明的第四个方面是提供含有本技术第二方面所述的核酸分子或第三方面所述表达盒、载体的基因工程细胞，优选的，所述的细胞为原核细胞，更优选的所述的细胞为革兰氏阴性菌；最优选的，所述的细胞为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
13.本发明的第五个方面是提供上述的酶突变体、编码核酸分子、表达盒、载体或基因工程细胞在制备抗性淀粉中的应用；优选的，所述的淀粉来源于大米淀粉。
14.本发明的第六个方面是提供上述的酶突变体、编码核酸分子、表达盒、载体或基因工程细胞在降低大米淀粉gi值的应用。
15.本发明的第七个方面提供一种降低大米gi值的方法，所述的方法为利用氨基酸序列如seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的糖原分支酶对大米淀粉进行改性。优选的，改性的温度为25～35℃，改性的ph为6～8、时间为6-12h；更优选的，先将大米淀粉加水制成淀粉浆，然后将淀粉浆糊化，得到糊化淀粉溶液温育至25-40℃后，加入糖原分支酶改性。
16.与现有大米抗性淀粉制备工艺相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：
17.1、提供了一种相对于出发酶vvgbe的酶活显著提高的酶突变体所述的突变体具有耐高温、耐酸特性，且更适用于大米淀粉的改性；
18.2、本专利制备工艺所得大米抗性淀粉相比酶法有更好的抗酶解能力；
19.3、本专利制备工艺所得大米抗性淀粉相比酶法有更低的血糖生成指数(gi值)。
附图说明
20.为了更清楚地说明本说明书实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书实施例中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为vvgbe蛋白结构预测图。
22.图2vvgbe及其突变体表达纯化后鉴定，1为野生型vvgbe,2为f224g,3为f224g/w316a，4为f224g/w316a/y410p。
具体实施方式
23.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员
在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
24.实施例1大米抗性淀粉制备
25.由于市面大米抗性淀粉中，抗性淀粉含量不均一，纯度较低。因此依据前期研究，自行制备大米抗性淀粉，作为统一酶解检测底物。
26.制备工艺包括：提取淀粉、酸水解、热压-冷却循环改性处理、烘干研磨过筛后得到大米抗性淀粉。
27.具体步骤如下：
28.提取：将米粒浸泡在0.30％(w/v)的naoh溶液中，4℃冷藏22h。沥干上清液，将米粒研磨成粉浆，然后过100目筛网。将粉浆以3000g/min离心15min，去除上清，向沉淀中加入2.5倍体积的去离子水后，以3000g/min离心15min后弃上清，并重复水洗离心操作3次，最后得到的沉淀物加入3倍体积去离子水，充分搅匀获得淀粉液。用1mol/l的hcl调节淀粉液至ph为6.9，然后以3000g/min离心15min，弃上清待用，得到大米淀粉。
29.酸水解：向制备好的大米淀粉中加入1.5倍(w/v)的1.5mol/l的hcl溶液，搅拌均匀后40℃恒温放置3h；用9％(w/v)的naoh溶液调节上述溶液ph为6.5，以1000g/min离心5min弃上清，并重复水洗离心操作3次，弃上清待用。取少量样品，60℃烘干，研磨成粉，过100目筛网用于检测。
30.热压-冷却循环改性处理：酸水解后的大米淀粉和去离子水按1:5的比例调浆，在85℃下恒温搅拌25min。将淀粉浆放到高压蒸煮锅中135℃蒸煮35min，高温高压蒸煮后的淀粉浆于4℃下冷藏20h。重复热压-冷却冷藏步骤3次。60℃烘干，研磨成粉，得到大米抗性淀粉。
31.实施例2酶突变体的获得
32.以野生型的来自创伤弧菌(vibrio vulnificus)的糖原分支酶vvgbe(氨基酸序列如seq id no:1所示)的为出发酶，经过蛋白结构预测其与底物淀粉的结合关键位置(如图1所示)，得出其与底物结合的结构域中，三个位置(f224、w316、y410)的氨基酸由于其r基团的阻挡可能影响底物与酶的结合，因此在不改变蛋白结构的情况下，对其进行饱和突变，经过预测和实验筛选，最终决定选择将其突变为如下目标氨基酸，f224g、w316a、y410p并对其活性进行验证。具体操作如下：
33.1)突变引物设计
34.根据vvgbe的编码基因(seq id no:5)所示，以上述突变方式进行突变引物的设计，如下表所述：
35.表1不同突变体的突变引物突变位置引物序列(5
’‑3’
)
[0036][0037]
2)突变体获得
[0038]
构建反应pcr扩增体系：
[0039]
高保真dna聚合酶0.5μl、
[0040]5×
buffer 10μl、
[0041]
dntp 4μl每个突变位点的两条引物各1μl、
[0042]
模板(含有seq id no.2所示的质粒pet-28a-vvgbe)4μl、
[0043]
水32.5μl；
[0044]
反应条件为：
[0045]
94℃3min；
[0046][0047]
72℃5min；
[0048]
12℃保温。
[0049]
将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板(消化体系为：dpni 0.5μl、上述反应pcr产物45μl、10
×
t buffer 5μl)，消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌bl21感受态细胞，化学转化法具体步骤：
[0050]
(a)将10μl同源重组产物导入100μl dh5α感受态细胞；
[0051]
(b)冰浴15-30min；
[0052]
(c)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；
[0053]
(d)加入800μl无抗性lb培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；
[0054]
(e)5000rpm离心2min收菌；
[0055]
(f)移去上清，剩余100-200μl吹吸混匀涂布至含0.05mg/ml卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。
[0056]
(g)挑取单克隆于含0.05mg/ml卡那霉素抗性lb中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。
[0057]
将测序正确的f224g突变体编码质粒作为模板，进行第二次的突变pcr，获得f224/y316a的突变体编码质粒，经测序验证选取正确突变的作为模板，进行第三次的突变。
[0058]
3)突变体表达
[0059]
将步骤2)制备得到的突变体编码质粒转化重组菌株，筛选获得阳性转化子接种至lb培养基，37℃培养至od600为0.6～0.8时加入终浓度0.1-0.5mm iptg诱导酶的表达，诱导温度为22-26℃，诱导时间8-16h，得到发酵液。
[0060]
发酵液于4℃、6000-8000rpm、离心10-20min，取菌体。
[0061]
加入10ml破解缓冲液(20mm tris、20mm咪唑、1％甘油，用hcl调ph至8.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，超声破碎。
[0062]
将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、11000rpm离心15min，得粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。
[0063]
利用akta蛋白纯化仪的操作protocol进行蛋白纯化。用破解缓冲液以3-5ml/min的流速平衡系统10-20min。上柱子之后，在用破解缓冲液平衡柱子10-20min。待系统基线稳
定后上样。上样结束后，继续用破解缓冲液冲洗杂蛋白至基线平衡。基线平衡后，利用洗脱程序通过洗脱液(20mm tris、500mm咪唑用hcl调ph至8.5)进行洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白，sds-page电泳后，考马斯亮蓝染色鉴定纯度(如图2)。
[0064]
实施例3不同分支酶突变体降低淀粉消化率的能力
[0065]
1)酶活检测(以市售马铃薯支链淀粉为实验材料，验证不同突变体酶的酶活)
[0066]
称取马铃薯支链淀粉0.5g加入至盛有缓冲液的烧杯中，沸水浴中加热煮沸30min，直至底物溶液澄清透明，然后用100ml容量瓶定容，得到底物溶液；称取0.26g碘和2.6g碘化钾加入至盛有蒸馏水的烧杯中，搅拌均匀，然后用10ml棕色容量瓶定容，得到卢戈斯溶液；
[0067]
将100μl卢戈斯溶液、50μl盐酸(2m)、26ml蒸馏水混合，得到终止液；
[0068]
设置对照组和实验组，其中，对照组：200μl底物溶液+200μl蒸馏水；实验组：200μl底物+200μl粗酶液；将对照组和未加酶液的实验组充分混匀后置于分支酶的最适温度(35℃)下孵育10min；10min后，在实验组中加入稀释好的粗酶液200μl，将其置于糖原分支酶的最适温度下反应15min；15min后，分别从对照组和实验组取200μl产物加入到4ml终止液中，避光放置20min左右，直至颜色稳定；20min后，在分光光度计下测定吸光值(a530)，计算糖原分支酶酶活。
[0069]
分支酶酶活的定义：单位时间单位体积内每减少1mg支链淀粉所需要的酶量定义为1个酶活单位(1u)。
[0070]
分支酶酶活的计算：
[0071][0072]
式中，a为分支酶酶活，单位(u/ml)；m0为对照组中支链淀粉含量，单位(mg)；m1为实
[0073]
验组中支链淀粉含量，单位(mg)；d为粗酶液稀释倍数；t为粗酶液与底物反应时间，单位(min)；v为粗酶液的体积，单位(ml)。
[0074]
表2不同突变体酶的酶活对比
[0075]
酶酶活u/mlvvgbe2.11f224g4.35f224g/w316a7.09f224g/w316a/y410p9.27
[0076]
2)抗性大米淀粉转化检测
[0077]
称取2.5g实施例1制备获得的样品加入50mm、ph 7.3的pbs缓冲液中，得到淀粉溶液；将淀粉溶液在沸水浴中加热搅拌15-30min，加热完毕，定容至100ml，配制成2.5％的糊化淀粉溶液；将糊化淀粉溶液置于30℃、150rpm恒温水浴摇床中温育10min，得到温育淀粉溶液；在温育淀粉溶液分别加入100、200、500、1000u/g淀粉的实施例2获得的糖原分支酶vvgbe突变体f224g,f224g/w316a,f224g/w316a/y410p,以野生型的vvgbe作为对照。空白对照组(control)不添加酶液，用缓冲液补足，在40℃条件下反应12h，加热煮沸灭酶终止反应，得到反应液。检测反应液中抗性淀粉(rs)含量，检测结果如见表3。由表3可知，糖原分支
酶vvgbe的突变体f224g、f224g/w316a,f224g/w316a/y410p较野生型的糖原分支酶vvgbe具有更高的抗性淀粉转化率，在制备抗性大米淀粉中极具应用前景。
[0078]
表3不同突变体酶处理所得的抗性淀粉含量
[0079][0080]
实施例4酶突变体的催化温度
[0081]
以野生型最佳的催化时间12小时为基础，对三个突变体蛋白的最佳反应温度进行实验条件实验，酶添加量设置为500u/g，将反应温度分别调整为25、30、35、40、45℃。检测反应液中抗性淀粉(rs)含量，检测结果如见表4。
[0082]
表4不同糖原分支酶在不同反应温度下反应获得的反应液中抗性淀粉(rs)的含量
[0083][0084]
由表3可知，引入突变使得酶具有了更高的最适温度，使得其具有一定的耐高温的特性，更适用于工业化的催化应用。
[0085]
实施例5酶突变体的催化ph值
[0086]
配置50mm、ph为5.5～6.0的柠檬酸缓冲液，50mm、ph为6.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以及50mm、ph为8.5的tris-hcl缓冲液；在实施例4的基础上，将50mm、ph7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液分别调整为配置得到的50mm、ph为5.5～6.0的柠檬酸缓冲液，50mm、ph为6.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液以及50mm、ph为8.5的tris-hcl缓冲液，并且，将酶的反应时间限定为12h、反应温度限定为35℃，酶添加量为500u/g，检测反应液中抗性淀粉(rs)含量，检测结果如见表5。
[0087]
表5不同糖原分支酶在不同反应ph反应获得的反应液中抗性淀粉(rs)的含量
[0088][0089]
由表5可知，突变后的酶具有一定的耐酸性，更适用于酶解过程中的酸化的环境，使得所述的酶具有更广谱的使用环境。
[0090]
实施例6突变体在降低大米淀粉gi值中的应用
[0091]
抗酶解性检测方法：精确称取1g样品溶于30ml磷酸盐缓冲液中(0.2mol/l，ph6.9)，在95℃水浴加热30min，待冷却到25℃后加入320单位的耐热α-淀粉酶，在90℃水浴振荡酶解2h后，用5ml的l％(质量浓度)硫酸终止酶解反应。离心后用80％乙醇洗没有被酶解的产物，再次离心后于80℃烘箱内将沉淀物干燥至恒重；
[0092][0093]
血糖生成指数(gi值)测定方法：准确称取50.00mg样品于样品杯中，加入α-淀粉酶与淀粉葡萄糖苷酶混合液进行反应5min,再加入5ml胃蛋白酶液反应30min,之后加入5ml胰脂肪酶液。此时，体外模拟消化仪器开始自动取样并测定样品的gi值，取样时间分别为10、60、120、180、240、300min。取样时间点的葡萄糖含量(gt)可以由葡萄糖标准曲线计算得出并根据以下公式计算水解率(％)并绘制出水解曲线。以白面包为参考标准，定义白面包的水解率为100％，按照gi与hi的关系式,计算出样品的gi值。
[0094]
水解率(％)＝gt
×
0.9/200。
[0095]
hi＝样品消化(水解)曲线下面积/参比标准样品消化(水解)曲线下面积
×
100。
[0096]
gi＝39.71+(0.549hi)。
[0097]
表6不同突变体酶对于大米淀粉的gi值改变情况
[0098]
[0099]
对照例
[0100]
以实施例6的方法利用所述的酶对于市售的玉米淀粉进行实验，观察所述的酶对于两种淀粉的gi值改变情况。
[0101]
表7不同突变体酶对于玉米淀粉的gi值改变
[0102][0103]
对照表6和表7发现，无论是野生型的酶vvgbe还是三个突变体，所述的酶更适用于对于大米淀粉的改性，可以特异性的用于大米淀粉gi值的降低。
[0104]
以上所述的具体实施方式，对本技术的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本技术的具体实施方式而已，并不用于限定本技术的保护范围，凡在本技术的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。