黄芪发酵菌质、制备方法及用途

文档序号:33507165发布日期:2023-03-18 03:10阅读:210来源:国知局
黄芪发酵菌质、制备方法及用途

1.本发明涉及一种黄芪发酵菌质、制备方法及用途。


背景技术:

2.中药发酵是借助微生物的作用,在一定的环境条件下(如湿度、温度等)对中药进行发酵,改变其原有性能、增强或产生新的功效,从而扩大用药品种,适应临床用药的需要。现代医学的研究表明,中药发酵可以使中药的毒性降低、增强或产生新的作用,从而拓宽中药的种类,以满足临床的需要,并可有效地提高中药的资源利用率,因此具有广阔的前景和应用价值。
3.黄芪是我国最古老的补中益气药之一,含有皂苷类、黄酮类、多糖类等多种活性成分,其中皂苷类成分有黄芪皂苷ⅰ、黄芪皂苷ⅱ、黄芪皂苷ⅲ、黄芪皂苷iv等成分,黄酮类成分有毛蕊异黄酮、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷等成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等药理作用。
4.cn 105193905 a公开了一种灵芝-黄芪双向发酵的中药加工技术,包括黄芪预处理、灵芝菌种活化、双向发酵培养基配制、双向发酵及药性变化和发酵菌质的处理。
5.cn 106880588 a公开了以一种陈皮茯苓口服液的制作方法,从试管斜面中挑取茯苓菌种接种到发酵培养基中,培养5-7天得茯苓发酵液。将茯苓发酵液煮沸30-40分钟,然后经过滤、调配、灌装、封口、灭菌即得成品。
6.以上方法虽然均将药材采用发酵处理,能一定程度上提高成分的转化率,也有一定的抗氧化能力,但是制备原料多,过程较为繁琐。


技术实现要素:

7.有鉴于此,本发明的第一个目的在于提供一种黄芪发酵菌质,其具有显著的抗氧化能力。
8.本发明的第二个目的在于提供上述黄芪发酵菌质的制备方法,其可以大大提高黄芪中黄芪皂苷iv的生物转化率、dpph自由基清除率和abts+自由基清除率。
9.本发明的第三个目的在于提供上述黄芪发酵菌质的用途。
10.本发明的第四个目的在于提供一种茯苓菌的用途。
11.本发明采用如下技术方案实现上述目的。
12.一方面,本发明提供一种黄芪发酵菌质,其由包括如下重量组分的原料经发酵而成:15~25重量份黄芪、4~12重量份茯苓菌发酵液和5~25重量份水。
13.根据本发明的黄芪发酵菌质,优选地,茯苓菌发酵液由如下方法制备得到:
14.将茯苓菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上在24~29℃和相对湿度为70~90%条件下活化培养3~6天,得到活化后的茯苓菌;将活化后的茯苓菌于马铃薯液体培养基中在发酵温度为24~29℃和转速为150~200r/min的摇床条件下液态发酵2~5天,得到茯苓菌发酵液。
15.根据本发明的黄芪发酵菌质,优选地,所述黄芪发酵菌质由如下方法制备得到:
16.将15~25重量份黄芪、4~12重量份茯苓菌发酵液和5~25重量份水在24~29℃下发酵6~12天。
17.另一方面,本发明提供上述黄芪发酵菌质的制备方法,包括如下步骤:
18.将15~25重量份黄芪、4~12重量份茯苓菌发酵液和5~25重量份水在24~29℃下发酵6~12天,得到黄芪发酵菌质。
19.根据本发明的制备方法,优选地,将黄芪和水混合,然后灭菌,得到第一混合物;将茯苓菌发酵液接种在第一混合物中,发酵,得到黄芪发酵菌质。
20.根据本发明的制备方法,优选地,还包括如下步骤:
21.将茯苓菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上在24~29℃和相对湿度为70~90%条件下活化培养3~6天,得到活化后的茯苓菌;将活化后的茯苓菌于马铃薯液体培养基中在发酵温度为24~29℃和转速为150~200r/min的摇床条件下液态发酵2~5天,得到茯苓菌发酵液。
22.根据本发明的制备方法,优选地,黄芪和水重量比为0.5~4:1。
23.根据本发明的制备方法,优选地,茯苓菌发酵液和黄芪的液固比为1:2~5。
24.再一方面,本发明提供的上述黄芪发酵菌质在制备抗氧化药物中的用途。
25.还一方面,本发明提供一种茯苓菌在发酵黄芪过程中提高黄芪皂苷ⅳ转化率中的用途。
26.本发明的黄芪发酵菌质具有显著的抗氧化能力。本发明的黄芪发酵菌质的制备方法可以大大提高黄芪中黄芪皂苷ⅳ的生物转化率和dpph自由基清除率和abts+自由基清除率。本发明的茯苓菌可以提高黄芪皂苷ⅳ转化率。
附图说明
27.图1为实验例1的黄芪发酵菌质及对照样品的dpph自由基清除能力对比图。
28.图2为实验例1的黄芪发酵菌质及对照样品的abts自由基清除能力对比图。
具体实施方式
29.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但本发明的保护范围并不限于此。
30.<黄芪发酵菌质>
31.本发明的黄芪发酵菌质由包括如下组分的原料发酵得到:黄芪、发酵菌和水。
32.在本发明中,水可以为任意饮用水,优选为纯净水,更优选为超纯水。黄芪可以为15~25重量份、优选为16~24重量份,更优选为18~22重量份。茯苓菌发酵液可以为4~12重量份,优选为6~10重量份,更优选为7~9重量份。水可以为5~25重量份,优选为7~20重量份,更优选为8~15重量份。采用上述配比的各组分,使得黄芪发酵菌质具有显著的抗氧化能力。
33.<黄芪发酵菌质的制备方法>
34.将黄芪和水混合,然后灭菌,得到第一混合物;将茯苓菌发酵液接种在第一混合物中,发酵,得到黄芪发酵菌质。
35.在本发明中,优选地,黄芪为黄芪粉末;黄芪粉末粒径可以为50~80目,优选为55~75目,更优选为60~65目。这样可以增大表面积,有利于药材与菌的充分接触,同时粉末形式下药材中的有效成分更容易浸出,极大提高提取率。
36.在本发明中,黄芪粉末和水重量比可以为0.5~4:1,优选为1~4:1,更优选为1.5~4:1。这样有利于后续发酵菌与黄芪充分接触,取得更佳发酵效果,发酵菌的生长率和黄芪发酵菌质的得率更高。
37.在本发明中,优选地,采用高压灭菌的方式,灭菌温度可以为110~150℃;优选为110~130℃;更优选为115~125℃。
38.在本发明中,灭菌时间可以为15~30min;优选为20~30min;更优选为25~30min。
39.在本发明中,优选地,茯苓菌发酵液由茯苓菌经过培养活化所得。茯苓菌为多孔菌科真菌茯苓poria cocos(schw.)wolf.,可以于市面上采购。
40.在本发明中,茯苓菌发酵液的培养方法可以为:将茯苓菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上在温度为24~29℃和相对湿度为70~90%的条件下活化培养3~6天,得到活化后的茯苓菌;将活化后的茯苓菌于马铃薯液体培养基中在发酵温度为24~29℃和转速为150~200r/min的摇床条件下液态发酵2~5天,得到茯苓菌发酵液。优选地,将茯苓菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上在温度为25~28℃和相对湿度75~85%的条件活化培养3.5~5.5天,得到活化后的茯苓菌;将活化后的茯苓菌于马铃薯液体培养基中在25~28℃和转速为160~190r/min的摇床条件下培养2.5~4.5天,得到茯苓菌发酵液。更优选地,将茯苓菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上在温度为26~27℃和相对湿度78~81%的条件下活化培养4~5天,得到活化后的茯苓菌;将活化后的茯苓菌于马铃薯液体培养基中在26~27℃和转速为170~185r/min的摇床条件下培养3~4天,得到茯苓菌发酵液。
41.在本发明中,茯苓菌发酵液和黄芪粉末的液固比可以为1:2~5,优选为1:2~4,更优选为1:2~3。这样能够将黄芪药材有效发酵,避免菌种浪费,同时获得更好的发酵效果。
42.在本发明中,优选地,采用固态培养的方式对黄芪进行发酵;发酵时间可以为6~12天,优选为8~11天,更优选为9~10天。这样能保证茯苓菌的活性,充分发挥发酵作用,且使发酵产物有效成分及活性更高。
43.在本发明中,发酵温度可以为24~29℃,优选为25-28℃,更优选为26-28℃。这样能保证茯苓菌的活性,充分发挥发酵作用,且使发酵产物有效成分及活性更高。
44.<黄芪发酵菌质的用途>
45.本发明的上述黄芪发酵菌质具有显著的抗氧化能力。采用dpph自由基清除率和abts+自由基清除率衡量其抗氧化能力。因此,本发明提供上述黄芪发酵菌质在制备抗氧化药物中的用途。
46.<茯苓发酵液的用途>
47.黄芪皂苷iv是黄芪中主要有效成分之一,是评价黄芪药材质量优劣的主要标准,经茯苓发酵液发酵后的黄芪中黄芪皂苷iv的转化率显著提高。因此,本发明提供一种茯苓菌在发酵黄芪过程中提高黄芪皂苷ⅳ转化率中的用途。
48.下面介绍测试方法。采用高效液相色谱法对上述方法所得的黄芪发酵菌质中各成分进行测定,测定条件如下:
49.黄酮类测定
50.利用phenomenex c18柱(4.60
×
250mm,5μm),对样品中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、染料木苷、芒柄花素、芒柄花苷进行定量分析。液相条件:流动相:a为0.05%甲酸水溶液,b为乙腈;采用梯度洗脱程序进行洗脱,梯度条件:0-5min,0-5% b;5-10min,5-20%b;10-25min,20-25% b;25-35min,25-30% b;35-40min,30-35%b;40-54min,35-40% b;54-55min,40-0% b;流速:1.0ml/min;柱温:30℃;进样量:10μl;检测波长:254nm。
51.皂苷类测定
52.利用phenomenex c18柱(4.60
×
250mm,5μm)对样品中黄芪皂苷iv和ii进行定量分析。液相条件:流动相:a为乙腈,b为超纯水;采用梯度洗脱程序进行洗脱,梯度条件:0-20min,96%-80%(b);20-40min,80%-70%(b);40-65min,70%-40%(b);65-70min,40-96%(b);70-80min,96%(b);流速:1.0ml/min;柱温:25℃;进样量:20μl;elsd的漂移管温度设置为100℃,载气流速为2.5l/min。
53.dpph自由基清除率的测定
54.(1)将样品干燥至固体状;
55.(2)精密避光称取dpph试剂8mg,用无水乙醇溶解后,转移至100ml的容量瓶,无水乙醇定容至刻度线,摇匀,得0.08mg/ml的dpph无水乙醇溶液;
56.(3)精确称取8mg干燥样品于离心管,加入8ml的无水乙醇溶解,得1mg/ml的样品母液。将样品母液稀释至所需浓度。精确吸取样品溶液100μl于离心管中,加入1ml的dpph无水乙醇溶液后,用无水乙醇补至4ml,摇匀,静置30min,在517nm处检测吸光度,记为a1。精确吸取样品溶液100μl于离心管中,用无水乙醇补足4ml,在517nm处检测吸光度,记为a2。吸取1ml的dpph无水乙醇溶液,加入3ml的无水乙醇,在517nm处检测吸光度,记为a3。用vc作为阳性对照。根据下列公式,计算样品的dpph自由基清除率%。
57.dpph自由基清除率(%)=100
×
(a3+a2–
a1)/a358.abts自由基清除率的测定
59.(1)将样品干燥至固体状;
60.(2)精密称取0.3841g 2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐于烧杯中,加入100ml的水。精密称取0.0662g过硫酸钾于烧杯中,加入100ml的水。将两者混合,摇匀,避光反应12~16h,即得abts+自由基溶液。用水将其稀释,使其在734nm处的吸光度a值为0.700
±
0.02,此溶液作为abts+工作液。
61.(3)精确称取干燥样品12mg于离心管中,加入1ml的水,即得12mg/ml的样品母液。将样品母液稀释至所需浓度。吸取0.1ml的不同浓度样品溶液于离心管中,加入4ml的abts+工作液,摇匀,静置6min后,在734nm处检测吸光度,记为a。吸取0.1ml的水,加入4ml的abts+工作液,摇匀,静置6min后,在734nm处检测吸光度,记为a0。吸取不同浓度的样品溶液,在734nm处检测吸光度,记为b。用vc作为阳性对照。根据下列公式,计算样品的abts+自由基清除率。
62.abts+自由基清除率(%)=[a
0-(a-b)]/a0×
100
[0063]
下面介绍原料:
[0064]
茯苓菌:poria cocos bio-08656,北京百欧博伟生物技术有限公司购买,北京市顺义区信中北街16号院3号楼4层432。
[0065]
制备例
[0066]
将茯苓菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)斜面培养基上,置于27℃、相对湿度80%的恒温恒湿箱活化培养5天,得到活化后的茯苓菌;然后用接种环挑取活化后的茯苓菌于马铃薯液体培养基中,于27℃、180r/min的摇床条件下培养4天,得到茯苓菌发酵液。
[0067]
实施例1
[0068]
称取20重量份粒径为60目的黄芪粉末,置于固态发酵袋中,然后向固态发酵袋中加入10重量份水,在121℃下高压灭菌25min,得到第一混合物。
[0069]
将8重量份制备例得到的茯苓菌发酵液于超净台内按无菌要求接种于第一混合物中,恒温培养箱内27℃固态培养10天,得到黄芪发酵菌质。
[0070]
实施例2
[0071]
除了黄芪发酵菌质的原料配比之外,其余制备过程与实施例1完全相同:
[0072]
黄芪发酵菌质由如下组分的原料制成:20重量份黄芪、9重量份茯苓菌发酵液和25重量份水。
[0073]
对比例1
[0074]
固态培养时间为15天,其余条件与实施例1完全相同。
[0075]
对比例2
[0076]
将茯苓菌替换为槐栓菌,其余条件与实施例1完全相同。
[0077]
对比例3
[0078]
除了未对黄芪发酵外,其余条件与实施例1完全相同。
[0079]
对实施例1~2和对比例1~3的黄芪发酵菌质进行活性成分的测定,以黄芪皂苷iv作为标准指标,结果如表1所示。
[0080]
表1
[0081][0082]
实验例1黄芪发酵菌质的功效评价
[0083]
将实施例1获得的黄芪发酵菌质进行抗氧化能力测试,同时与未发酵黄芪进行对比,并以vc作为参照,dpph和abts的抗氧化能力分别如图1和图2所示。
[0084]
通过上述实验可知,本发明的黄芪发酵菌质总体具有较好的抗氧化能力,发酵后的黄芪发酵菌质dpph自由基清除率和abts+自由基清除率分别达到63.81%和98.60%,比未发酵的黄芪分别提高了24%和43%。
[0085]
本发明并不限于上述实施方式,在不背离本发明的实质内容的情况下,本领域技
术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
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