与烟草株高相关性状基因qPH和qIL，连锁SSR标记及其应用的制作方法

与烟草株高相关性状基因qph和qil，连锁ssr标记及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记及其应用。


背景技术：

2.烟草株高性状包括植株的自然高度和节距，属于烟草农艺性状。与烟草其他农艺性状一样，株高性状也属于易受环境影响的数量性状。前人关于烟草农艺性状(包含烟草植株自然高度和节距)的qtl分析主要是集中在利用非特异性标记(如rapd、issr、aflp、scar等)构建的局部烟草遗传图谱进行的，因此，在很大程度限制了qtl定位结果在烟草育种中的进一步应用。tong等利用一个烟草加倍单倍体(dh)群体和基于该群体构建获得的ssr标记遗传图谱，对包含株高、节距、叶数等6个与烤烟产量相关农艺性状的qtl定位分析(tong z j,jiao f c,wu x f,et al.mapping of quantitative trait loci underlying six agronomic traits in flue-cured tobacco(nicotiana tabacum l.)[j].acta agronomica sinica,2012,38(8):1407-1415.)。基于k326与y3构建的重组自交系群体，童治军等对株高、节距、叶数、茎围、茎叶角度、腰叶长和腰叶宽7个与产量相关农艺性状进行了qtl分析，针对株高性状其结果是，在连续两年均检测到了1个具有较大效应值(r2﹥20％)的qtls，即，qph17(r2＝23.18％,2016；21.37％,2017)和qil17(25.75％；20.09％)，且株高相关性状基因(qph和qil)均在第17号连锁群上被检测到。连续两年被检测到的与烟草株高相关性状基因qph和qil位于ssr标记pt53015和pt53756标记之间约1.62cm(34.522-32.906)区域内(童治军，焦芳婵，陈学军，吴兴富，方敦煌，肖炳光.7个烤烟产量相关性状的qtl定位分析.西北植物学报，2018,37(7):1235-1243.)。虽然与烟草株高相关性状基因qph和qil的效应值较高，但因与其两侧连锁的ssr标记间遗传距离相对较大(＞1cm)而不能作为理想的分子标记应用于烟草株高性状的遗传改良。


技术实现要素：

[0003]
本发明的第一目的在于提供一种与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记；第二目的在于提供所述的与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记的应用。
[0004]
本发明采用如下技术方案实现。
[0005]
为简捷、精准、高效的选择同时具有qph和qil基因而呈现高植株性状的后代材料，本发明提供一种用于检测烟草株高相关性状基因qph和qil的分子标记tm37949和tm29165，该分子标记采用数量性状连锁分析(qtl)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与烟草株高相关性状基因qph和qil连锁的共显性ssr标记，可用于株高相关性状基因qph和qil的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及高植株烟草品种选育的效率。
[0006]
与烟草株高相关性状基因qph和qil，本发明所述的株高相关性状包含烟草植株自然高度性状和烟草植株节距性状，控制烟草株高相关性状基因为qph和qil且属于数量性状
基因位点。
[0007]
一种与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记，本发明所述的与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tm37949和tm29165；其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。
[0008]
本发明所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
[0009]
tm37949序列为：
[0010]
tm37949f：5
’‑
caaacagaggcgaactcaga-3’(seq id no.5)，
[0011]
tm37949r：5
’‑
cagaacatcccagggaaaaa-3’(seq id no.6)；
[0012]
tm29165序列为：
[0013]
tm29165f：5
’‑
ttgcctcgtagcgatagaaaa-3’(seq id no.7)，tm29165r：5
’‑
gtcaaaacaactggaaatgcaa-3’(seq id no.8)。
[0014]
本发明上述的与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记的应用，所述的与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在株高相关性状基因qph和qil中的应用。
[0015]
本发明所述应用的步骤包括：以tm37949序列的引物和tm29165序列的引物分别扩增待检测烟草基因组dna，
[0016]
tm37949序列为：
[0017]
tm37949f：5
’‑
caaacagaggcgaactcaga-3’(seq id no.5)，
[0018]
tm37949r：5
’‑
cagaacatcccagggaaaaa-3’(seq id no.6)；
[0019]
tm29165序列为：
[0020]
tm29165f：5
’‑
ttgcctcgtagcgatagaaaa-3’(seq id no.7)，tm29165r：5
’‑
gtcaaaacaactggaaatgcaa-3’(seq id no.8)。
[0021]
检测pcr扩增产物；分析pcr扩增产物。
[0022]
本发明上述pcr扩增产物为：如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no.1和seq idno.3所示序列则表明该待测烟草植株含有株高相关性状的显性纯合等位基因qphqph和qilqil，基因型记为hh；
[0023]
本发明上述pcr扩增产物为：如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no.2和seq idno.4所示序列则为待测烟草植株含有株高相关性状的隐性纯合等位基因qphqph和qilqil，基因型记为hh；
[0024]
本发明上述pcr扩增产物为：如果pcr扩增产物中含有如seq id no.1和seq id no.2所示序列，或含有如seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有如seq id no.1、seq idno.3和seq id no.4所示序列，或含有如seq id no.3、seq id no.1和seq id no.2所示序列即为含有株高相关性状的杂合等位基因qphqph和qilqil、qphqph和qilqil、qphqph和qilqil，基因型记为hh。
[0025]
本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供了一种用于检测具有烟草株高相关性状基因qph和qil的分子标记，与文献报道的烟草株高相关性状基因标记相比，本发明所提供的标记更具有显著优势：(1)株高性状概念不同，已报道的文献将烟草株高性状定义为烟草植株的自然高度；而本发明中所涉及的株高性状概念既包含烟草植株的自然高
度，也包含与自然高度密切相关的节距。(2)更精细的qtl定位结果，相较于文献已报道的烟草株高相关性状qtl定位结果，本发明提供的与烟草株高相关性状基因qph和qil两侧紧密连锁标记间的遗传距离更小、定位精度更高且结果的可重复性、准确性也更高，因此，用作烟草株高性状选育的分子标记进行辅助选择的结果也更科学、精准。
附图说明
[0026]
图1是基于烟草重组自交系群体(rils_f
7:8
；红花大金元
×
beinhart1000-1)的株高相关性状qtl分析曲线图。
[0027]
其中，qtl定位软件为：winqtlcart v2.5；参数设置：定位方法为cim：composite interval mappingqtl，迭代次数为1000(permutation times＝1000)，显著性为0.01(significance＝0.01)，步长为0.5cm(walk speed＝0.5cm)。图中横坐标为遗传距离(单位：厘摩cm)；纵坐标为lod值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的lod值＝7.2；lod曲线最高点为烟草株高相关性状的主效基因/qtl(qph17和qil17)。
具体实施方式
[0028]
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照相关产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0029]
本发明以高植株雪茄烟品种beinhart1000-1和矮植株烤烟品种红花大金元为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有341份株系的烟草重组自交系(rils_f
7:8
)为作图群体，利用数量性状连锁分析(qtl)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记，以加速分子标记辅助选择(mas)在烟草株高性状新品系选育中的精准、高效利用。
[0030]
本发明所述的共显性ssr标记具有精准、高效、稳定、便捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草株高性状育种中qph和iil基因分子标记辅助选择的应用。
[0031]
本发明所述的与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tm37949和tm29165，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。
[0032]
所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
[0033]
tm37949序列为：
[0034]
tm37949f：5
’‑
caaacagaggcgaactcaga-3’，
[0035]
tm37949r：5
’‑
cagaacatcccagggaaaaa-3’；
[0036]
tm29165序列为：
[0037]
tm29165f：5
’‑
ttgcctcgtagcgatagaaaa-3’，
[0038]
tm29165r：5
’‑
gtcaaaacaactggaaatgcaa-3’。
[0039]
本发明所述的与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记的应用为所述的与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在株高相关性状基因qph和qil中的应用。
[0040]
所述的烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁的共显性ssr标记的应用是分别以tm37949序列的引物和tm29165序列的引物扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物，如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no.1和seq id no.3所示序列即为该烟草植株含有株高相关性状的显性纯合等位基因qphqph和qilqil；如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no.2和seq id no.4所示序列则为待测烟草植株含有株高相关性状的隐性纯合等位基因qphqph和qilqil；如果pcr扩增产物中含有如seq id no.1和seq id no.2所示序列，或含有如seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有如seq id no.1、seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有如seq id no.3、seq id no.1和seq id no.2所示序列即为待测烟草植株中含有株高相关性状的杂合等位基因qphqph和qilqil、qphqph和qilqil、qphqph和qilqil。
[0041]
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
[0042]
实施例1
[0043]
采用数量性状连锁分析(qtl)法，在烟草全基因组范围内筛选与烟草株高相关性状基因qph和qil连锁的共显性ssr标记
[0044]
一、实验材料以综合性状优良但矮植株烤烟品种红花大金元为母本，以高植株雪茄烟品种beinhart1000-1为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(rils_f
7:8
)作为遗传作图群体。二、亲本及rils_f
7:8
群体株高相关性状表型数据获得
[0045]
株高相关性状调查按照烟草行业标准yc/t 369-2-10进行，其中包括植株自然高度和植株节距，具体测量方法如下：
[0046]
自然植株高度：采用杆尺，测量自地表茎基处至第一青果柄基部间的长度。
[0047]
节距：沿着烟株的主茎从下往上占整个株高的1/3的位置称腰部，在烟株腰部的上下各测量两个相邻叶片的基部间距离，然后取平均值。
[0048]
三、ssr标记分析
[0049]
烟草基因组dna提取：采用常规ctab法或植物组织dna提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
[0050]
pcr扩增及电泳检测：pcr扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献，其中，本发明所提供的标记退火温度均为60℃；pcr扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。
[0051]
利用本实验室开发的ssr标记，对341份rils_f
7:8
样品进行基因型分析和连锁分析，并绘制一张含有24条连锁群且均匀分布1974个ssr标记，覆盖烟草基因组长度为3213.138cm的高质量烟草ssr遗传连锁图谱。以此图谱及ssr标记的基因型值作为rils_f
7:8
群体的基因型值，用于下一步的qtl连锁分析。
[0052]
四、烟草株高相关性状基因(qph和qil)的全基因组qtl分析
[0053]
利用qtl定位分析软件winqtlcart v2.5对rils_f
7:8
群体的基因型数据和表型数据，对烟草株高相关性状基因qph和qil进行全基因组qtl扫描。其中，相关参数设置为：定位方法选cim：composite interval mapping qtl，迭代次数为1000(permutation times＝1000)，显著性为0.01(significance＝0.01)，步长为0.5cm(walk speed＝0.5cm)。最后，在全基因组范围内的lod＝7.2条件下，位于第17号连锁群的111.40cm处定位获得连续3年(2020、2021和2022)的烟草株高相关性状的1个主效qtl(命名为qph17和qil17)。该主效qtl
可解释约26.52％(qil17，2022)～50.05％(qph17，2022)的表型变异率，且lod值约为27.11(qil17，2022)～61.21(qph17，2022)，详见图1和表1。
[0054]
表1烟草株高相关性状qtl(qph和qil)信息统计
[0055][0056]
实施例2
[0057]
共显性连锁标记在rils_f
8:9
群体单株中的验证
[0058]
首先，利用获得的与烟草株高相关性状基因qph和qil两侧紧密连锁的共显性ssr标记tm37949和tm29165，对苗期的rils_f
8:9
群体(红花大金元
×
beinhart1000-1)单株进行基因型分析，获得rils_f
8:9
群体各单株的基因型数据。其次，按照烟草行业标准yc/t 369-2-10对各株系的株高相关性状进行测量。最后，分析341份rils_f
8:9
群体的基因型数据与株高相关性状的表型值，发现本发明公布的两个共显性ssr标记tm37949和tm29165的基因型值与表型值完全吻合，即，一致率达100％。具体的分析方法为：通过测量获得各株系的自然植株高度和节距表型值高于或等于高值亲本beinhart1000-1时，该株系的基因型中也是同时呈现如seq id no.1(208bp)和seq id no.3(169bp)所示序列即为该株系含有株高相关性状的显性纯合等位基因qphqph和qilqil；鉴定获得的各株系的自然植株高度和节距表型值等于或低于低值亲本红花大金元时，该株系的基因型中也是同时呈现如id no.2(240bp)和seq id no.4(177bp)所示序列即为该株系含有株高相关性状的隐性纯合等位基因qphqph和qilqil；而当鉴定获得的各株系的自然植株高度和节距表型值介于低值亲本红花大金元与高值亲本beinhart1000-1之间，也即与子一代(f1)相近时，该株系的基因型中也是同时呈现如seq id no.1和seq id no.2所示序列，或含有seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有seq id no.1、seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有seq id no.3、seq id no.1和seq id no.2所示序列即为该株系含有株高相关性状的杂合等位基因qphqph和qilqil、qphqph和qilqil、qphqph和qilqil。
[0059]
以上结果表明，共显性标记tm37949和tm29165分别与烟草株高相关性状基因qph和qil紧密连锁，该两个标记位于目的基因/qtl(qph17和qil17)两侧，且两个标记间遗传距离约为0.50cm。利用上述两个共显性紧密连锁ssr标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草幼苗期的株高相关性状鉴定，而且也可清晰鉴别待测植株中的株高相关性状基因型状态，此既提高了株高相关性状烟草新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。
[0060]
seq id no.1：
[0061]
caaacagaggcgaactcagaatttttacgtgacgggatatatttaaattaaccattttta
[0062]
aggtatatatatatatatatataagatttcagccgaacatatgggtccgcctctgtgtacaa
[0063]
acatgctttattgatgttgaacaacctatagctagcctctgccctctctaaaagttttctt
[0064]
cgctttttttccctgggatgttctg
[0065]
seq id no.2：
[0066]
caaacagaggcgaactcagaatttttacgtgacgggatatatttaaattaaccattttta
[0067]
aggtatatatatatatatatatataagatttcagccgaaatttacggggtccgtgacccctc
[0068]
acccatacatatgggtccgcctctgtgtacaaacatgctttattgatgttgaacaacctat
[0069]
agctagcctctgccctctctaaaagttttcttcgctttttttccctgggatgttctgseq id no.3：
[0070]
ttgcctcgtagcgatagaaaagatatggtctctaacgaaaatgactgattgcccattttt
[0071]
gttggtctttgactggttggacaaagatctgttgatagctatatatatatatatatatatatg
[0072]
ctcacattctgatattcaagaaagttgcatttccagttgttttgacseq id no.4：
[0073]
ttgcctcgtagcgatagaaaagatatggtctctaacgaaaatgactgattgcccattttt
[0074]
gttggtctttgactggttggacaaagatctgttgatagctatatatatatatatatatatata
[0075]
tatatatgctcacattctgatattcaagaaagttgcatttccagttgttttgacseq id no.5：
[0076]
caaacagaggcgaactcaga
[0077]
seq id no.6：
[0078]
cagaacatcccagggaaaaa
[0079]
seq id no.7：
[0080]
ttgcctcgtagcgatagaaaa
[0081]
seq id no.8：
[0082]
gtcaaaacaactggaaatgcaa
[0083]
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。