一种水稻叶色调控基因OsALB3及其应用

一种水稻叶色调控基因osalb3及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种水稻叶色调控基因osalb3及其应用，属于植物基因工程和水稻分子遗传育种领域。


背景技术：

2.水稻是世界上最重要的粮食作物之一，提高水稻产量对于保障全球粮食安全具有重要意义。水稻产量大部分来自于叶片的光合作用，而光合作用的进行依赖于叶绿体的正常发育。
3.在高等植物中，叶绿体是含有遗传物质的半自主细胞器，通常被认为是光合细菌经内共生过程而来。在内共生过程中，大多数原核生物基因组丢失或转移到核基因组中。因此，大部分叶绿体蛋白是由核基因编码，并通过不同的转运途径将其运输到叶绿体中的。叶绿体信号识别颗粒通路(cpsrp)对核编码的叶绿体蛋白向类囊体膜转运具有重要作用。这一通路包括三个主要组分：cpsrp蛋白、膜结合srp受体cpftsy和膜整合蛋白alb3。在拟南芥中，cpsrp通路蛋白编码基因的突变均导致叶片黄化。在水稻中，仅有cpsrp43和cpsrp54参与水稻叶色的相关报道，而alb3基因的功能还未有研究。对水稻alb3基因进行功能研究，有助于深入了解植物叶绿体蛋白转运及光合作用调控机制，为培育高产水稻奠定基础。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水稻叶色调控基因osalb3及其应用。
5.本发明的目的是这样实现的：水稻叶色调控基因osalb3，其特征在于,所述基因osalb3的核苷酸序列如seq id no .1所示。
6.所述编码蛋白氨基酸序列如seq id no .2所示，还包括在所示的氨基酸序列中插入、取代或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
7.所述水稻叶色调控基因osalb3在调控水稻叶色中的应用。
8.所述调控是通过rnai及基因敲除方法降低水稻叶色调控基因osalb3编码蛋白的表达或活性，从而使水稻叶片颜色黄化随后苗期死亡或叶绿体蛋白运输效率降低，光合作用下降。
9.本发明方法先进科学，本发明提供了一种水稻叶色调控基因osalb3，该基因的核苷酸序列如seq id no .1所示。本发明还同时提供了水稻叶色调控基因osalb3编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如seq id no .2所示。
10.进一步地，本发明提供了水稻叶色调控基因osalb3在参与叶绿体发育和叶绿体蛋白运输过程中的应用。
11.克隆水稻叶色调控基因的方法是mutmap+，对难以进行杂交的作物中的基因分离有潜在的应用。
12.本发明所涉及的水稻叶色调控基因osalb3的突变是由粳稻品种日本晴经ems诱变
产生的。osalb3叶片为淡黄色且苗期致死，叶绿素含量相较于野生型显著降低。通过透射电镜观察野生型与osalb3的叶绿体超微结构，发现osalb3中的类囊体膜数量减少，说明osalb3基因参与水稻叶绿体的发育。通过mutmap+技术定位到loc_os01g05800为osalb3的候选基因。osalb3是loc_os01g05800基因发生单碱基替换导致第140位氨基酸发生改变。通过crispr/cas9基因编辑技术敲除osalb3基因，获得与osalb3叶片黄化表型一致的转基因水稻，证明loc_os01g05800基因即为致使osalb3叶片黄化的基因。
13.上述水稻叶色调控基因osalb3是水稻叶绿体信号识别颗粒通路(cpsrp)的一部分，主要负责将叶绿体光合蛋白复合体整合至类囊体膜上供水稻进行光合作用。在osalb3中光合蛋白复合体含量降低，引起水稻光合效率下降。
14.相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明通过mutmap+技术从水稻叶片黄化突变体osalb3中克隆获得osalb3基因，并利用基因编辑技术进行了功能验证。osalb3是一种核编码的叶绿体蛋白。该基因的突变体苗期叶片黄化且后期出现植株死亡现象。由于osalb3参与cpsrp通路运输叶绿体蛋白，因此该基因的突变可导致叶绿体蛋白整合效率降低，引起植株光合作用下降。解析osalb3的功能，对进一步理解叶绿体发育和叶绿体蛋白运输机制具有重要作用，同时可为提高水稻光合作用效率和培育高产水稻提供新的思路。
附图说明
15.图1为野生型与osalb3的叶色表型和叶绿素含量测定；其中，a为野生型和osalb3生长10天左右的表型；b为野生型和osalb3生长24天左右的表型；c为野生型和osalb3在生长10天左右的叶绿素含量的测定。
16.图2为野生型与osalb3叶绿体超微结构的透射电镜观察。
17.图3为mutmap+方法克隆osalb3基因；其中，a为野生型池及突变体池中水稻第一号染色体snp-index分布图；b为突变体池中水稻第一号染色体snp-index分布图；c为osalb3筛选流程；d为osalb3的基因结构和osalb3突变位点。
18.图4为野生型与敲除突变体osalb3-1的基因型与表型。
19.图5为osalb3在水稻不同组织中的表达和亚细胞定位；其中，a为osalb3在不同组织的相对表达；b为gfp在水稻原生质体中的瞬时表达；c为osalb3-gfp融合蛋白在水稻原生质体中的瞬时表达。
20.图6为捕光蛋白在野生型和osalb3中的蛋白含量。
具体实施方式
21.下面通过具体实施例对本发明作进一步的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
22.实施例1：osalb3的表型鉴定和遗传分析；通过ems诱变水稻品种日本晴，从后代中筛选出叶片黄化突变体osalb3。与野生型的绿色叶片不同，osalb3苗期叶片表现为淡黄色，且在生长24天左右出现死亡的现象。光合色素含量的测定表明osalb3淡黄色叶片表型是由于叶绿素a、叶绿素b含量降低引起的。
23.通过透射电镜观察野生型和osalb3叶绿体的超微结构。结果显示与野生型相比，osalb3中类囊体膜数量非常少，几乎没有任何粒层的堆积。因此，osalb3中叶绿体发育存在缺陷。
24.利用杂合株系自交获得种子，后代中99株正常株和55株黄化苗，经过卡方检验(x2=1.973＜x2=3.84)符合3：1分离比，表明突变体性状是由单个隐形核基因控制的。
25.实施例2：osalb3基因的克隆和转基因编辑验证；本发明通过mutmap+技术克隆出突变基因osalb3。mutmap+利用同一家系的野生型与突变型单株的dna按等比例混合成2个不同的池，分别进行重测序并与亲本品种的全基因组序列比对，获得全基因组所有snp的snp-index值。将两池中snp-index做差，根据δsnp-index确定突变基因的位置。
26.为了克隆osalb3基因，选择单株收获杂合m2代种子，通过种植m2代观察到幼苗表型分离比约为3：1的m3代，选取黄化幼苗30株和野生型植株30株混池进行重测序。根据重测序结果，可以在突变体池和野生型池中共得到27000多个不同的突变。根据mutmap+的数据分析原理，我们采用如下的突变筛选规则：突变体池中的snp-index=1；野生型池中的基因型为aa和aa，因此野生型池中snp-index《0.5。经过筛选，全基因组只有一个snp符合条件，该snp位于osalb3（loc_os01g05800）内。分别提取野生型和突变黄化幼苗叶片的dna进行测序验证。测序分析显示，在突变体中loc_os01g05800基因中发生单碱基替换，由c突变成t，导致编码的第140位氨基酸由丙氨酸(ala)突变为缬氨酸(val)。这与mutmap+克隆结果一致，确定引起突变体叶片黄化的基因为loc_os01g05800。该基因全长为4470bp，cds长度为1383bp。
27.为更进一步验证osalb3表型是否是loc_os01g05800的突变引起的，在osalb3基因编码区设计一个crispr/cas9基因敲除靶点，其引物序列如下：靶点：gttcatgtgccgtactctta (seq idno .3)敲除载体构建所用引物：alb3-f: 5
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ttcatgtgccgtactcttagttttagagctagaaat 3
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(seq id no .4)alb3-r: 5
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taagagtacggcacatgaacggcagccaagccagca 3
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(seq id no .5)构建osalb3基因的敲除载体，转化背景材料日本晴的愈伤组织中。经基因型鉴定获得敲除突变体osalb3-1。与野生型相比，osalb3-1的叶片颜色黄化且在苗期死亡。该结果进一步验证了loc_os01g05800基因的突变引起了osalb3叶色黄化表型。
28.实施例3：osalb3基因表达分析及蛋白亚细胞定位；利用trizol方法提取野生型日本晴的根、茎、叶、幼穗和花前穗的总rna，使用反转录试剂盒反转录成cdna进行qpcr反应。结果显示，osalb3基因在根、茎、叶、幼穗和花前穗中都有表达，且在叶中表达量最高。
29.为了研究osalb3的亚细胞定位模式，构建了osalb3-gfp融合表达载体，使用水稻原生质体进行瞬时表达实验。在激光共聚焦显微镜下观察到osalb3-gfp融合蛋白的绿色荧光信号与叶绿体自发荧光信号重叠，表明osalb3定位在水稻叶绿体中。
30.实施例4：类囊体膜光合蛋白复合体亚基蛋白含量检测；osalb3是cpsrp通路中的一部分，负责将相关捕光蛋白整合到类囊体膜上进一步发挥作用。为探究osalb3功能的缺失是否对叶绿体光合相关蛋白复合体产生影响，我们提
取野生型与osalb3的全蛋白，通过western blot技术检测野生型与osalb3中相关光合蛋白的含量。结果显示，相较于野生型，osalb3中的光系统ⅰ(psⅰ)和光系统ⅱ(psⅱ)的光合蛋白亚基的含量显著降低。因此，osalb3基因对叶绿体光合蛋白复合体亚基的积累具有重要作用。
31.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
32.seq id no .1：aacgactacctcttcttcctcctctcgcaccaccaccactcaccaccccccaccccccacctccaccctcctcctcctcctccgcctcggcgttcgtgcatgaaaccctagaccccccccccctctaaacccccctccctcccgcaccccccgcgatggccaaggcgctcctctcctcgtcgctgctcccctcgctgcagccccgcgccgccgccgcgaggctgcctatgctgacgctgccttcgctgcggaggcacgggggccgccgcgcgtcggcgtgcagggtgagggcgagcctccacgggctcgactcgatcgcggggctcgacctccacgccgcgctggagcgcgccgaggcggcgctctacacgctcgccgacgccgctgtcgtcgcggcggacgcggcggcgggaggaggagggggtggcggtggtggtggcggtgaagcggcggcgtcggtggcgcagaagaacggggggtggttcgggttcatctccgaggccttggaggtcgtgcttaaggtaagcgccgccgtcttctcccaaacctataggaatccaagtcactttaggagttcaggttcaggattgctaagattggttaatggatatatccctgagttgcaaaagttggtctggtgaattggttggggaattggagatttggagtcatgtaagttcgtggagagtgcaggagtagatgtgcatgcacttaattatgacgcctccatgctctgaaacttactaaacattgagcagacggcaacccggcatggttatttttaagtaacttatatctagttatgaccaggcgtgcattgtttagcattttcctatccacaggttttgatatgaaatgttacaattcaagaactgttaggattttattgcatagcattcatcggctccggaatgctgatactatgtgagtatcaccatacaggtgctgaaggatggcctgtcagctgttcatgtgccgtactcttatggattcgccatcattcttctcactgttattgtgaaggctgcaacattacctttaacgaaacaacaggtaaatgataaaatctggtctattttttaattaatgagtaacatggatatggtgggttgagagttgtgctgtttttcctctctttttttaggtcgaatcaactctggctatgcagaatttacagccacagatcaaagcaattcaacagagatatgcaggaaatcaggtttgttttgtttatcttttacgcacgccatggatattaaagtaggaacactgaggtttgtttctggatatatgttttgcatattttaacgatagaaggtagaactatcttcccaaaaaatgttcttatttcactgttgtgttttatattttcaagcacatatctttgggcatttctgatctatcactcctacataactcttattaggaaaggatacagcttgagactgctcggttatacaagcaagctggagtcaaccctctggcaggtcgcttacttctccattctttagcctattaactttgatagttgaattgttccattgcatcttttttgtatgagtttgttatttattagttgatcatattttctatttctcgacataatgcatctattgccatcatgtgcttgcaaaaccaattgttggctttttaaagttttaagtgagattgcttttgtgatatagtgttttgatattatggtttctcttccaggatgttttccaactttggcaacaatacctgtctggattggcctctaccaagccctttcaaatgtagcaaacgaggtaaaactcaaatcctgcttcctaatatttgcttcattaagaggattttgttctaagtggcttatatttctctgaagggattactgacagaaggatttttctggattccatctttgggaggccctacaacaattgctgctcggcaaagtggtgctggcatttcttggctcttgccttttgtggtaataaaattgatcacacgttaacatatatcaacaatttcattgctgatctaggaaaatcaggtttatagtgcacttgagcgaatttaacctcattttccccccttatttgactttgacatacccgtcaagttagattagtgtcacgtttctgcccatagtcatttaagcaatcaagcaacaagaagcttagctatttgcacctcgcattttgttgcctattatttagaactctggttgaaataaatggcgtggcataccaatttatagtcctgtagagacatgatagtaaaacagcatattactcatgtacttgcataatattgagatggtaaatcatacttacaacttaaatgaattgtgcaggatggccatcctccattaggctggcatgacacgatatgttatcttgtgttgcctgtgctacttgttgcttctcagtttgtctctatggaaatcatgaagccaccccaggtgagcagacgag
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