定向驯化改造的益生菌、含有该益生菌的微生态制剂及其在妇科炎症中的应用的制作方法

1.本发明涉及合成生物技术领域，尤其涉及将传统中药发酵与驯化益生菌相结合的生物合成技术。


背景技术：

2.妇科炎症的治疗主要有药物治疗、物理治疗和手术治疗。普通的妇科炎症，比如阴道炎、宫颈炎、附件炎，医院常规采用服用抗生素结合中成类药物综合治疗，比如服用罗红霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、甲硝唑、替硝唑、诺氟沙星、罗红霉素等，结合服用妇科千金片、女宝胶囊、妇乐片、金鸡胶囊等药物。也使用阴道局部用药，比如双唑泰栓、保妇康栓、消糜栓等有一定的治疗效果。由于女性的生殖器官位于盆腔内，药物很难直达病灶，因此还有使用激光、离子透入、微波、红光等物理治疗的方法进行辅助治疗。对于妇科炎症比较严重的患者，往往使用手术方法来进行治疗，比如严重宫颈糜烂、宫颈息肉都需要手术进行治疗。传统的中成药物、抗生素类药物等治疗妇科炎症的原理基本一致，杀菌，在杀灭病菌的同时杀灭了人体的有益菌，导致人体微生态失衡，长期使用还产生抗生素耐药性，妇科炎症反复发作成为顽疾，中成药洗液不仅破坏女性生殖道微生态环境，过敏反应，过敏体质者需要审慎使用，会导致阴道局部的微环境的改变，对于外阴白色病变、糖尿病所导致的瘙痒不能使用。
3.未婚和绝经后的妇女，因为阴道黏膜发育不成熟或者是黏膜的萎缩，用药期间患者会出现刺痛、皮肤潮热等反应。部分患者会出现灼热、疼痛、皮疹、皮肤瘙痒等皮肤过敏状况。
4.抗生素长时间应用会产生以下危害：一，诱发细菌耐药。二，损伤人体器官。抗生素在杀菌同时也会造成人体损伤，影响肝肾功能，出现胃肠道反应。三，导致二重感染。在正常情况下，人体的各个器官、部位都有细菌寄生，寄生菌群寄生菌群在相互拮抗下维持着平衡状态，如果长期使用广谱抗菌药物，敏感菌会被杀灭，而不敏感菌乘机繁殖，未被抑制的细菌、真菌及外来菌也可乘虚而入，诱发又一次新的感染。抗生素的复发率高，三个月的复发率高达30％。在国内，抗生素曾长期存在滥用情况，因此也一度被称为“吊瓶大国”。世界卫生组织驻华代表处、卫生系统与卫生安全组组长马丁(martin taylor)在2015年接受《南方日报》专访时援引权威数据介绍，“过去10年中，中国半数以上门诊患者获得了处方的抗生素，这远远超过世卫组织建议的限值(30％以下)”。《内蒙古中医药》2012年发表的《抗生素的滥用与对策》一文中指出，1995～2007年疾病分类调查数据显示，中国感染性疾病占全部疾病总发病数的49％，其中细菌感染性占全部疾病18％～21％。也就是说，真正需要使用抗生素的病人数不到20％，80％以上属于滥用抗生素。2021年4月7日，国家卫健委医政医管局发布了《关于进一步加强抗微生物药物管理遏制耐药工作的通知》(以下简称为《通知》)，要求进一步落实《抗菌药物临床应用管理办法》有关要求，规范细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、真菌等病原微生物所致感染性疾病药物治疗。而其中，抗生素是抗微生物药物
里最主要的一大类药物，包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、多肽类、林可霉素类等。最新的通知也意味着，在近年一系列“限抗令”之后，抗生素类药物将进一步被严控。这不是抗微生物药物第一次被点名。为遏制抗菌药物的滥用，2011年国家曾启动一项为期三年的全国行动，重点改善二级及以上公立医院的抗生素合理使用；2012年卫生部发布《抗菌药物临床应用管理办法》；2015年8月，《抗菌药物临床应用管理办法》正式实施(2020年5月，世界卫生组织、联合国粮食及农业组织、世界动物卫生组织将“抗菌药物”更名为“抗微生物药物”)。
5.2020年7月，《国家卫生健康委办公厅关于持续做好抗菌药物临床应用管理工作的通知》中规定，各地加强感染性疾病科建设、提高感染性疾病医疗质量；医疗机构优化抗菌药物供应目录、提高药学专业技术服务水平、加强重点环节管理等。而本次的《通知》则进一步提出，将抗微生物药物合理使用情况纳入医院评审、公立医院绩效考核、合理用药考核等工作，并适当加大考核权重的要求。中华人民共和国卫生部令第84号《抗菌药物临床应用管理办法》中第二条本办法所称抗菌药物是指治疗细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、真菌等病原微生物所致感染性疾病病原的药物，不包括治疗结核病、寄生虫病和各种病毒所致感染性疾病的药物以及具有抗菌作用的中药制剂。
6.妇科疾病中成药常见主要有栓剂和洗液两种形式。栓剂、洗液都有消炎、抗菌的作用，但是其缺点是不能起到持久治疗的目的，此外女性的阴道是有正常的菌群的，阴道的酸碱度是适于这些正常细菌生长繁殖的，现在治疗妇科炎症的洗液品类非常多，滥用洗液，会导致阴道菌群失调，破坏阴道的酸碱平衡。栓剂一般用药都在晚上，如果白天使用，则易使药物经阴道流出。部分中成药栓剂、洗液还存在用药后的残留物、余毒等不利于女性身体健康的副作用。
7.中成药洗液不仅破坏女性生殖道微生态环境，过敏反应，过敏体质者需要审慎使用，会导致阴道局部的微生态环境的改变，如外阴白色病变、以及未婚和绝经后的妇女，由于阴道黏膜发育不成熟或者是黏膜的萎缩，用药期间患者会出现刺痛、皮肤潮热等反应。部分患者会出现灼热、疼痛、皮疹、皮肤瘙痒等皮肤过敏状况。
8.妇科疾病的新型治疗方式为微生态制剂药品，微生态系统是正常微生物群与环境和宿主构成相互制约、相互作用的统一体，微生态系统构成—开放的黏膜部位包括：口腔微生态系统、消化道微生态系统、皮肤微生态系统、生殖微生态系统、其他微生态系统。女性阴道内有300多种微生物，1)革兰阳性需氧(或兼性)菌，如乳酸杆菌、非溶血性链球菌、肠球菌等，2)革兰阴性需氧(或兼性)菌，如大肠杆菌、加德纳菌等。3)厌氧菌，如梭状芽孢杆菌、消化链球菌、类杆菌及梭形杆菌等。4)其他，如支原体及假丝酵母菌等。正常阴道中数量最多的优势菌是乳酸杆菌，每克阴道分泌物含有107～108cfu乳杆菌,其优势地位发生改变时，就会发生菌群失调，引发阴道炎症。阴道正常ph值为3.8～4.5，阴道ph值的变化可直接反映阴道内以乳杆菌为主的微生物菌群变化。
9.生殖道微生态系统失衡相关疾病常被简称为abctv，具体表现有：细菌性阴道病(bacterial vaginosis，bv)，需氧菌性阴道炎(aerobic vaginitis，av)，假丝酵母菌病(vulvovaginal eandidiasis，vvc)，滴虫阴道炎(triehomonad vaginitis，tv)，细胞溶解性阴道病(cytolyticvaginosis，cv)，老年性阴道炎也伴随微生态失衡阴道微生态是动态平衡体系，环境中“生理菌”与“病原菌”相互制约、相互协调，随卵巢功能、激素水平、妊娠、
月经周期等因素的变化而变化
10.国内目前批准上市的阴道微生态制剂药物仅有两种，一种是内蒙古双奇药业股份有限公司生产的商品名为“定君生”的胶囊型药品主要成份为一种乳杆菌-德氏乳杆菌(lactobacillus delbrusckii)，该菌种不属于我国女性阴道优势菌种。一种是西安正浩生物有限公司生产的商品名为“延华”胶囊型药品，主要成份为一种活性肠链球菌(streptococcus faecalis)，该菌种不是阴道优势菌种。而且，以上两种微生态制剂药品均需在一定温度下低温保存储藏，应用、使用范围存在一定的局限性，治疗费用偏高，市售价格1粒高达9元。同时仅在城镇的医院、医疗机构处方开具，目前还无法普及到广大偏远农村地区。
11.然而中国还有约40％的人口在农村，农村妇女的妇科疾病问题不容忽视。
12.因此，除了妇科保健卫生知识的教育普及，妇科炎症的用药安全、方便性、多样性、价格承受能力也是本领域亟需解决的问题。


技术实现要素：

13.本发明的目的之一，就在于提供驯化益生菌，以解决上述问题。
14.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种定向驯化改造的益生菌，所述益生菌的改造方法包括下述步骤：
15.(1)称取石斛5-8份、黄连1-3份、黄柏1-3份、虎杖2-4份、蛇床子3-6份、苦参3-6份、香薷5-8份、冰片1-2份，混合并粉碎后，提取，得到提取液和药渣，其中，所述提取液作为发酵基质；
16.(2)先向步骤(1)所得的发酵基质中按发酵原料总重量添加13％-18％的酵母菌和5％-8％的纳豆芽孢杆菌，进行无菌有氧28-32℃恒温发酵24h-30h，停止发酵后，再加入乳杆菌进行厌氧发酵42h-48h，发酵完成后进行恒温酶解2h-4h，得到基础培养液；
17.(3)采用步骤(1)的药渣再次添加2-4倍重量的纯化水，添加菊苣菊粉、乳酸菌，28-32度℃恒温发酵，提取，提取液与步骤(2)所得基础培养液混合，然后巴氏消毒，得到复合培养基质；
18.(4)菌株驯化：将嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌乳亚种(lactobacillus属)、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌与步骤(3)所得的复合培养基质混合进行菌株驯化，即得。
19.合成生物学是本世纪发展起来的一门新兴的交叉融合学科，目前其研究应用主要包括包括生物元件、基因线路、代谢工程、基因组工程等领域。本发明是将中药发酵与菌株驯化改造两种不同学科领域进行交叉融合的成果，本发明的菌株的驯化是有目的，指向性的驯化，即是一种合成生物领域中的代谢工程应用，即高度复杂药物分子生物发酵生产，依赖于对菌株的发现和工程化的高度理解。
20.合成生物是以“建构”为核心的新型交叉技术学科，将生物学与其他学科及范式进行深度交叉融合，充分发挥定量、设计、工程化等特征，是一门基础性合工具性学科，dna合成、基因编辑、高通量生物实验的突破带来可能性。比如开发或者发现一种新的具有经济价值的菌株，往往要耗费上千万的巨额研发费用以及上百名研发人员数年的研究时间，而合成生物工程化的特点可以将智能制造理念从工业2.0/3.0/4.0引入到生物研发，快速，低成
本的使用自动化和高通量设备，大规模，结构化的数据作为新的生产资料，优化实验设计，将研发经验沉淀为平台化的研发能力，进而实现产品落地成功率、速度、数量并行的规模化提升。
21.本发明基于定向/定量设计，培育，打破中医发酵和微生态两个领域的界限，进行深度融合，定向设计，定量改造，达到设计、生产目的。
22.益生菌目前的应用更多是在畜牧、农业上，包括发酵的应用。在人体健康上的应用，当前最热门的是肠道，因为人体近70％的菌株在肠道，前世界、全国范围内也以肠道为主。而本技术是专门针对生殖系统的应用，即本发明是将已经公认的安全的有益菌进行定向改造后，与中药发酵领域结合，打破传统的方式，从而得到一种能够安全、有效应用于妇科炎症的具有良好的温度耐受性、具有适于女性生殖道适宜的ph值、活菌含量高的微生态制剂产品。即本发明明显提高了现有益生菌的菌株的活性、耐温性，使菌株衰退期延长，菌株数含量明显提高。
23.本发明优选女性阴道环境的优势菌株嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌乳亚种(lactobacillus属)，卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌，并采用特殊的中药复方提取物对菌株进行驯化改造，保留有益菌原有结构和特性，并提高菌株活性，解决了原始益生菌环境温度承受能力低，生存周期短的问题。一般益生菌制剂的保存温度在2-6℃，活性乳酸菌需在冷藏0-4℃保存，并且益生菌的生产运输和保存需要冷链，因为随着温度的升高，益生菌就进入发酵的状态，活性也会逐渐降低；而经过本发明驯化处理的菌株生存力更强，活性成份提高、衰退期延缓，显著提高了微生态制剂中菌株常温下长时间状态的存活率。中药中的脂溶性成分在中成药的生产过程中起着不同程度的副作用，本发明采用亚临界萃取法在中药加工前的脱脂处理，有助于降低药物毒性。
24.基于生物合成的思路，本发明通过多联发酵方式，达到设定的目标：包括ph值达到3.8-4.4或4.2-4.5，这是正常女性生殖道环境的ph值；提高菌株的耐温性，延长衰减周期，提高应用于人体环境的有益菌数量，菌落数量是治疗效果的基础保障。
25.作为优选的技术方案：所述提取方法为亚临界低温萃取：在0.88-5.15mpa压力下，以亚临界状态的液氨对物料进行逆流萃取,提取液中溶剂经蒸发工序，使溶剂汽化与萃取出的目标成分分离,得到所述发酵基质，汽化的溶剂经压缩换热后被液化,循环使用。
26.亚临界流体萃取相比其它分离方法具有许多优点:无毒、无害，环保、无污染、非热加工、保留提取物的活性产品不破坏、不氧化，产能大、可进行工业化大规模生产，依据不同的的溶剂的极性，可萃取目标物的极性范围大，节能、运行成本低，有一定的萃取选择性，萃取液蒸发耗能少，易于和产物分离，更利于中药(含复方)活性成分的提取与有害脂溶性成分的分离。
27.作为优选的技术方案：步骤(3)中，添加的菊苣菊粉的浓度为180-220g/l，添加的乳酸菌的量为发酵原料总质量的22％-30％；所述发酵温度为30-35℃，发酵时间为20-30h；所述提取方法为：55-65℃下采用液氨萃取至少两次，合并萃取液，浓缩去除溶剂。
28.作为优选的技术方案：步骤(4)中，驯化方法为：将每一种发酵菌种分别与复合培养基质按150-200
×
108cfu发酵菌种/kg复合培养基质的比例充分混合搅拌,然后置于35-38℃恒温培养10-15h，分别得到驯化詹氏乳杆菌、驯化卷曲乳杆菌、驯化嗜酸乳杆菌、驯化德氏乳杆菌亚种。
29.作为进一步优选的技术方案：在复合培养基质中，分别按发酵原料总质量加入前述所得驯化詹氏乳杆菌2％-5％、驯化卷曲乳杆菌3.5％-5％、驯化嗜酸乳杆菌2.5％-5％、驯化德氏乳杆菌亚2％-5种，放置于40-42℃下恒温发酵10-15h，分别得到驯化詹氏乳杆菌发酵原液、驯化卷曲乳杆菌发酵原液、驯化嗜酸乳杆菌发酵原液、驯化德氏乳杆菌亚种发酵原液共四种发酵原液。
30.已上市的两款微生态制剂药品“定君生”、“延华
””
每0.25g产品中的活菌含量分别为2.5
×
105cfu、6
×
106cfu，而本发明优选通过多联发酵、驯化改良后的菌株出厂含量可增加到百亿cfu以上，显著提高微生态制剂中菌落数的含量，达到女性生殖环境所需的有益菌含量，有效提高预防及辅助治疗效果。
31.本发明的目的之二，在于提供一种含有上述驯化益生菌的微生态制剂，采用的技术方案为：所述微生态制剂的制备方法为，按照所述复合培养基质的质量为基准计，将所述驯化詹氏乳杆菌发酵原液3％-5％、驯化卷曲乳杆菌发酵原液5％-8％、驯化嗜酸乳杆菌发酵原液2％-5％、驯化德氏乳杆菌亚种发酵原液2％-5％分别与复合培养基质均匀混合，再加入复合培养基质质量3％-6％的纳豆芽孢杆菌，30℃恒温静置2-4h，用纯化水溶解，再按溶解后物料质量的0.15-0.3
‰
的比例依次加入聚六亚甲基双胍0.05％-0.08％、乳酸1.8％-2.4％和透明质酸钠3％-5％,全部均匀混合，得到半成品；
32.再在所述半成品里添加以半成品质量为基准计百分含量2％-7％的低聚果糖混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
33.作为优选的技术方案：所述制剂为液体剂型或半固体剂型或泡沫剂型。
34.如前所述，现有两款微生态制剂药品仅有胶囊剂型，局限于医疗机构及药房，费用偏高，使用时需要用手将胶囊放入阴道深处，存在一定的不卫生安全隐患，也不能对女性生殖道深处褶皱部位进行全面覆盖，影响治疗效果。而本发明的制剂可开发为膏状、半固体、液态、泡沫等多种剂型，且形态表现形式多样，能在多种基材中长时间存活保存，经工艺化后形成的产品使用安全卫生、更方便，可开发成多种型号产品，并可作为日常补充护理使用，长时间保护和稳固女性生殖系统健康微生态环境，且有效降低生产成本，容易实现工业化量产，有效降低治疗费用，解决现有微生态制剂药品应用范围局限，费用偏高，使用不方便的问题。
35.本发明的目的之三，在于提供上述的微生态制剂在制备防治妇科炎症的药物中的应用。
36.本发明还提供了一种微生态制剂在制备预防妇科炎症的妇女外用卫生保健品中的应用。
37.作为优选的技术方案：所述妇科炎症为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌中的任意一种或多种致病菌引起。
38.即本发明的微生态制剂，可以是传统的药用，但是，药用的使用场景等受限，所以，本发明的微生态制剂，还可以制成妇女外用卫生保健品等形式，即申请民用字号，如“消准字”，“械字”等，与“国药准字”搭配从而扩大用途范围和使用场景、方式；如前所述的，这样的新的应用，解决了必须去医院开具处方的限制，从而扩大应用范围和场景。
39.本发明还能解决抗生素类药物对人体的不良反应及长期使用的副作用的问题，也解决了传统中成药对人体微生态环境的破坏、过敏、吸收不彻底、余毒，杀灭病菌同时杀灭
益生菌，导致炎症反复的副作用的问题。
40.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明将中药提取物用于益生菌的多联发酵驯化改造，保留中药精华的活性药理功能的同时，添加高分子聚合物获得的产品能对女性阴道中的白色念珠菌(atcc10231)、大肠杆菌(8099)、金黄色葡萄球菌(atcc6538)有效抑制，调节女性生殖环境菌群平衡、改善和提高女性生殖道免疫力和抵抗力；另外，本发明通过多联发酵的方式，以提高菌株的耐温性，延长衰减周期、降低ph值，本发明的微生态制剂可用于预防和辅助治疗女性妇科炎症，还具有成本低、使用方便等优点。
附图说明
41.图1为本发明实施例1的制备流程图；
42.图2为本发明实施例1的经过驯化后菌株与生殖部黏膜细胞粘附测试图；
43.图3为本发明实施例1的经过驯化后菌株聚集白色念珠菌效果图。
具体实施方式
44.下面将结合附图对本发明作进一步说明。
45.实施例1：
46.一种含有驯化益生菌的微生态制剂，其制备方法参见图1,包括如下步骤：
47.(1)确定中药配方：石斛60g、黄连38g、黄柏45g、虎杖55g、蛇床子40g、苦参40g、香薷35g、冰片15g，按照所述配方称取中草药材，筛选除去杂质，用超细粉碎机将药材粉碎至200目,由气流输送进入萃取罐，抽直溶，注入亚临界低温溶剂液氨进行浸泡，料溶体积比为1：1.4，萃取温度38℃，萃取工作压力1.5mpa,时间设定为60min,萃取6次，初次萃取的萃取液打入分离罐进行溶剂和药液的分离，抽取上清液，其余的萃取液通过逆流萃取收集作为下批物料的溶剂使用，将上清液酸碱沉淀调至ph4.5-6.5，进行固液分离，巴氏杀毒，获得发酵基质；气化后的溶剂气体再经过压缩机压缩冷凝液化后可循环使用；
48.(2)将步骤(1)所得的发酵基质置于清洗干净，消毒后的发酵罐中，添加酵母菌和纳豆芽孢杆菌，添加量按质量比计，发酵基质78％、酵母菌10％、纳豆芽孢杆菌12％，合计100％，进行无菌有氧恒温35℃发酵24h，停止发酵后再加入前述发酵原料总质量3.5％的乳杆菌进行厌氧发酵48h，发酵完成后进行恒温30℃静置2h，得到基础培养液，所述基础培养液的ph值为5.2；
49.(3)采用步骤(1)的药渣中加入菊苣菊粉，并加入纯化水使菊苣菊粉浓度达到200g/l,然后添加乳酸菌，添加量为乳酸菌占物料的3wt％，35℃恒温发酵24h，输送进入萃取罐，注入亚临界低温溶剂液氨，料溶体积比为1：1.4，萃取温度38℃，萃取工作压力0.5mpa,时间设定为40min,萃取次数5次，初次萃取的萃取液打入分离罐进行溶剂和药液的分离，其余的萃取液通过逆流萃取收集作为下批物料的溶剂使用，进行固液分离，巴氏杀毒，得到复合培养基质，所述复合培养基质的ph值为4.5；气化后的溶剂气体通过压缩机压缩冷凝液化后循环使用；
50.(4)菌株驯化：将嗜酸乳杆菌(160
×
108cfu发酵菌种/kg复合培养基质)、德氏乳杆菌乳亚种(160
×
108cfu发酵菌种/kg复合培养基质)、卷曲乳杆菌(180
×
108cfu发酵菌种/kg复合培养基质)、詹氏乳杆菌(160
×
108cfu发酵菌种/kg复合培养基质)与复合培养基质充
分混合搅拌,置于38℃恒温培养12h，进行菌株驯化，分别得到驯化詹氏乳杆菌、驯化卷曲乳杆菌、驯化嗜酸乳杆菌、驯化德氏乳杆菌亚种；
51.(5)在步骤(3)所得复合培养基质中，分别以复合培养基质为质量基准加入前述所得驯化詹氏乳杆菌3％、驯化卷曲乳杆5％、驯化嗜酸乳杆菌3％、驯化德氏乳杆菌亚3％，混合均匀，然后置于43℃下恒温发酵12h，分别得到驯化詹氏乳杆菌发酵原液(ph值4.1)、驯化卷曲乳杆菌发酵原液(ph值3.9)、驯化嗜酸乳杆菌发酵原液(ph值4.3)和驯化德氏乳杆菌亚种发酵原液(ph值4.5)共四种发酵原液；
52.(6)步骤(3)所得的复合培养基质中，分别以复合培养基质为质量基准加入步骤(5)所得到的驯化詹氏乳杆菌发酵原液3％、驯化卷曲乳杆菌发酵原液6％、驯化嗜酸乳杆菌发酵原液3％和驯化德氏乳杆菌亚种3％发酵原液，均匀混合，再加入复合培养基质质量2％的纳豆芽孢杆菌，置入消毒后的密封罐静置3h，用纯化水溶解，按溶解后总物料质量比例0.0.4
‰
加入聚六亚甲基双胍，全部均匀混合，得到半成品；
53.(7)在步骤(6)所得到的半成品里添加质量百分含量5％的低聚果糖作为益生元成份，混合均匀后，在无菌条件下进行灌装包装，得到成品。
54.所得成品采用菌落计数仪、依据gb4789.2-94《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》测量菌落数，结果每0.25g产品中活菌含量为1.15
×
10
10
cfu，而相同质量相同条件相同方法测定现市售产品“定君生”、“延华
””
的活菌含量分别为2.5
×
105cfu、6
×
106cfu。
55.对比例1
56.本对比例与实施例1相比，不采用中药提取物，而采用基本培养基(蒸馏水1l、葡萄糖0.5％、硝酸铵1.0g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钠1.5g/l、氯化钠1.0g/l、七水硫酸镁0.2g/l调ph 7.2)替代，其余与实施例1相同。
57.对比例2
58.本对比例与实施例1相比，取消步骤(5)，其余与实施例1相同。
59.实施例2
60.将实施例1、对比例1、对比例2所得的成品，进行相关性能测试：
61.(1)ph值：经测定，所得实施例1的成品ph值为4.2-4.5(ph值是产品达到符合人体环境所需要的数值；正常女性有两种判断值，3.8-4.4,4.2-4.5)。
62.而对比例1的ph值为5.7，对比例2的ph值为6.3；
63.(2)乳酸含量及稳定性：
64.检测器材：1)电子分析天平bs224s，2)电子分析天平me155du，3)bsc-250恒温恒湿箱，4)高效液相色谱仪u-3000，组合制备样品品的乳酸含量为0.982％，经在稳定性条件(37℃-40℃，相对湿度75％,保存90天)后，乳酸的含量为0.966％，其下降率为1.63％。检验依据：gb5009.157-2016，符合《消毒技术规范》》2002版，根据企业标准q/cdsf02-2022的相关要求，实施例1所得样品储存有效期为2年；
65.而对比例1的储存有效期为2年，对比例2的储存有效期为1.5年。
66.(3)铅坤汞检测：使用检测器材：1)电子分析天平bs224s，2)原子吸收分光光度计990afg，3)原子荧光光度计afs-8820，经测定，制备物铅含量为《1.5mg/kg,坤含量为《0.010mg/kg,汞含量《0.002mg/kg,符合《化妆品安全技术规范》2015版相关要求。
67.(4)微生物学指标检测：
68.检测器材：1)stx1202zh电子天平，2)普通营养琼脂培养基，沙氏琼脂培养基，scdlp液体培养基，乳糖胆盐发酵培养基，血琼脂平板，由北京陆桥技术有限责任公司提供；3)hpx-9272mbe电热恒温培养箱，4)载体：滤纸片(2.0cm*3.0cm)、无菌刻度吸管、无菌平皿、无菌试管、剪刀、镊子、酒精灯等，
69.试验菌株：大肠杆菌(8099)，培养5代、白色念珠菌(atcc10231)，培养5代、金黄色葡萄球菌(atcc6538)，培养4代，均由中国菌种保藏中心提供。
70.0.03mol/l磷酸盐缓冲溶液(pbs)
71.检验依据：依据gb15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录b，及《消毒技术规范》2002版直接进行试验。
72.抑菌试验样品为悬液试验，试验温度为20℃，试验重复三次。制备物原样作用20分钟，对大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(atcc10231)、金黄色葡萄球菌(atcc6538)作用不同时(min)的平均抑菌率分别为下表。
73.实施例1样品对大肠杆菌的抑菌效果：
[0074][0075]
而对比例1样品对大肠杆菌的抑菌效果
[0076][0077]
对比例2样品对大肠杆菌的抑菌效果
[0078][0079]
注：阳性对照组(金黄色葡萄球菌肉汤培养物/普通琼脂)，平均生长菌落数为2.21
×
104cfu/ml，
[0080]
阴性对照组(普通肉汤)无菌生长，试验结果具有明显抑菌作用。
[0081]
实施例1样品对金黄色葡萄球菌的抑菌效果：
[0082][0083]
注：阳性对照组平均生长菌落数为2.36
×
104cfu/ml。
[0084]
阴性对照组无菌生长，试验结果具有明显抑菌作用。
[0085]
而对比例1样品对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
[0086][0087]
对比例2样品对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
[0088][0089]
样品对白色念珠球菌的抑菌效果
[0090][0091]
注：阳性对照组平均生长菌落数为2.51
×
104cfu/ml；
[0092]
阴性对照组无菌生长，试验结果具有明显抑菌作用。
[0093]
而对比例1样品对白色念珠球菌的抑菌效果
[0094][0095]
对比例2样品对白色念珠球菌的抑菌效果
[0096][0097]
另外，实施例1的步骤(5)驯化改造后的嗜酸乳杆菌
[0098]
lactobacillusacidophilus、德氏乳杆菌亚种lactobacillus、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌聚集白色念珠菌效果如图3所示，从图3中可以看出，联合形成聚集作用，包围病原菌后产生抑菌物质，干扰病原菌吸附。
[0099]
(5)阴道黏膜刺激试验：
[0100]
动物试验：由陕西君行生物科技有限公司1)提供新西兰兔6只，雌性，体重2.0-2.5kg,许可证号：syxk(陕)2018-007号，饲料来源同上。
[0101]
测试依据《消毒技术规范》2002版中2.3.5方法进行实验。
[0102]
受试物剂量：2ml/只。
[0103]
试验方法：6只非发情期新西兰兔随机分成2组，分别为受试物组和对照组，每组3只。试验时动物仰卧固定，受试物组经阴道注入受试物2ml/只，对照物给予同容积生理盐水，动物仰卧固定4h，使受试物与阴道粘膜充分接触。试验结束后动物放回笼内饲养，24h后处死动物取出阴道组织，肉眼仔细观察血管充血、水肿等现象，若有变化做病理组织学检查。
[0104]
试验结果：经观察受试物组家兔阴道粘膜形态正常，无充血、肿胀。送检原样对家兔阴道粘膜刺激反应平均评分为0。根据卫生部2002版《消毒技术规范》中阴道粘膜刺激反应分级标准，原样对家兔阴道粘膜刺激反应属无刺激性，符合《消毒技术规范》2002版相关要求。
[0105]
另外，步骤(5)驯化改造后的菌株与生殖部黏膜细胞粘附测试：
[0106]
准备如下实验材料：
[0107]
1.fibronectin、laminin；2.0.2％bsa(in pbs)；3.mtt；4.pbs；5.dmem；6.培养基；7.酶标仪；8.移液器及吸头；
[0108]
实验步骤如下：
[0109]
1).在酶标条内加入用pbs稀释的fibronectin(10μg/ml)或laminin(10μg/ml)，4℃孵育过夜；
[0110]
2).吸去fibronectin或laminin，pbs洗三遍后，用0.2％的bsa室温封闭2小时，再用dmem洗三遍；
[0111]
3).胰酶消化细胞，计数，稀释成2.5
×
105/ml的细胞悬液，每孔加入100μl细胞稀释液，37℃培养30分钟(具体时间需根据不同的细胞而定)；另设只加入100μl dmem孔，作为空白对照；
[0112]
4).dmem洗三遍，洗去未黏附的细胞，再加入200μl dmem。
[0113]
5).mtt法检测酶标条中细胞的数量(具体方法请参考“mtt法测定细胞增殖”章节)。
[0114]
6).黏附细胞百分数(％)＝(od测定孔－od对照孔)/od100
×
100％。
[0115]
结果如图2所示，表明：本发明经过驯化改造后的益生菌具有良好的粘附和定殖性能，可持续发挥维持生殖道菌群平衡，减少感染复发生殖系统炎症的几率。
[0116]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。