一种酶转化合成脱氧胆酸的方法与流程

本发明属于生物工程，具体涉及一种酶转化合成脱氧胆酸的方法。

背景技术：

1、脱氧胆酸(deoxycholic acid)分子式c24h40o4。是一种参与膳食脂肪乳化或溶解的次级胆酸，是胆酸失去一个氧原子而得到的一种游离胆酸，在胆汁中主要以牛磺酸、甘氨酸结合形式存在。脱氧胆酸及脱氧胆酸盐(deoxycholate)具有表面活性，作为化妆品和药剂中安全有效的乳化剂使用，同时具有抗真菌和抗炎作用，临床上也常用作利胆药。将脱氧胆酸注射到皮下脂肪组织时会导致脂肪细胞溶解，所以通常用在医学美容领域。目前美国和欧盟已经批准脱氧胆酸的微量注射液(10mg/ml)可以应用上述国家和地区，以改善成人中与颏下脂肪相关的中度至重度凸度或饱满度的外观，这是目前唯一获准治疗下巴以下脂肪的方法。经皮下注射的脱氧胆酸不会改变脂质(即游离脂肪酸、总胆固醇或甘油三酯)或脂肪因子(例如白细胞介素-6或-15、c反应蛋白、肿瘤坏死因子-α、载脂蛋白b、脂联素)在人体内的临床检测水平。脱氧胆酸这种特殊的促进脂肪细胞溶解的功能和特有的安全性使其在国内和国外医学美容市场的需求量都很大。

2、目前脱氧胆酸及脱氧胆酸盐的合成主要以化学合成为主。例如cn106083969a公开了以9α-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮为起始物料，经消除反应、还原反应、witting反应等步骤制备获得脱氧胆酸及脱氧胆酸盐的方法。cn114716497a公开了一种化学合成脱氧胆酸盐的方法，主要涉及提供了一种制备脱氧胆酸盐中间产物的方法。化学法合成和相关的制备过程涉及的步骤多、反应条件苛刻及催化剂要求较高。

3、与化学合成相比，酶转化或生物合成法发展迅速，其具有环境友好、过程无需高压催化剂要求，污染小且产物得率高。cn107099516a公开了一种通过酶转化获得脱氧胆酸的方法。通过分子进化获得活性和稳定性均提高的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体并通过异源表达获得这种重组突变体酶制剂，将该重组突变体酶制剂应用在熊脱氧胆酸合成中，后与固定化7α-羟基甾醇脱氢酶酶法耦联，可以直接催化廉价底物鹅脱氧胆酸的差向异构，连续转化制备熊脱氧胆酸。cn108546691a公开了一种通过蛋白质工程获得的辅酶偏好性改变的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体，通过重组表达该突变体酶制剂，可以实现酶法使耦联的辅酶再生，使重组突变体酶制剂可以高效利用氧化型辅酶(nad+)，从而替代昂贵的氧化型辅酶(nadp+)。将该突变酶用于催化7-羰基石胆酸的不对称还原，可以降低生产成本且具有操作简单、反应条件温和、产率高等优势。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种酶转化合成脱氧胆酸的方法。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，包括如下步骤：

4、(1)将胆酸辅酶a转移酶的基因片段插入到pet28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如seq id no：01所示；

5、(2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆酸辅酶a转移酶；

6、(3)将上述重组胆酸辅酶a转移酶、胆酸或别胆酸和脱氧氯酰辅酶a混合进行酶促反应用，再经纯化分离，获得脱氧胆酸。

7、在本发明的一个优选实施方案中，所述胆酸辅酶a转移酶的基因片段由如seq idno：02所示的baif-f和如seq d no：03所示的baif-r，以闪烁梭菌的基因组dna为模板，经pcr扩增获得。

8、进一步优选的，所述pcr的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，55℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环。

9、在本发明的一个优选实施方案中，所述胆酸或别胆酸和脱氧氯酰辅酶a的质量比为1-3∶1。

10、进一步优选的，所述酶促反应的ph为6-7，温度为30-37℃，转速为150rpm，时间为0.5-1h。

11、来源于闪烁梭菌的胆酸辅酶a转移酶在酶转化合成脱氧胆酸中的应用。

12、在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

13、(1)将所述胆酸辅酶a转移酶的基因片段插入到pet28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如seq id no：01所示；

14、(2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆酸辅酶a转移酶；

15、(3)将上述重组胆酸辅酶a转移酶、胆酸或别胆酸和脱氧氯酰辅酶a混合进行酶促反应用，再经纯化分离，获得脱氧胆酸。

16、进一步优选的，所述胆酸辅酶a转移酶的基因片段由如seq id no：02所示的baif-f和如seq id no：03所示的baif-r，以闪烁梭菌的基因组dna为模板，经pcr扩增获得。

17、进一步优选的，所述pcr的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，55℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环。

18、进一步优选的，所述胆酸或别胆酸和脱氧氯酰辅酶a的质量比为1-3∶1，所述酶促反应的ph为6-7，温度为30-37℃，转速为150rpm，时间为0.5-1h。

19、本发明的有益效果是：本发明首先获得重组表达胆酸辅酶a转移酶基因的质粒，通过重组大肠杆菌高效表达胆酸辅酶a转移酶后，将其应用于转化胆酸或别胆酸，可将胆酸或别胆酸和脱氧氯酰辅酶a混合物转化为胆酰辅酶a或四氯酰辅酶a和脱氧胆酸的混合物，通过分离获得脱氧胆酸，具有酶反应时间短、转化率高和产品纯度高的优势，具备良好的工业化生产应用前景。

技术特征：

1.一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述胆酸辅酶a转移酶的基因片段由如seq id no：02所示的baif-f和如seq id no：03所示的baif-r，以闪烁梭菌的基因组dna为模板，经pcr扩增获得。

3.如权利要求2所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述pcr的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，55℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环。

4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述胆酸或别胆酸和脱氧氯酰辅酶a的质量比为1-3：1。

5.如权利要求4所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述酶促反应的ph为6-7，温度为30-37℃，转速为150rpm，时间为0.5-1h。

6.来源于闪烁梭菌的胆酸辅酶a转移酶在酶转化合成脱氧胆酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述胆酸辅酶a转移酶的基因片段由如seqid no：02所示的baif-f和如seq id no：03所示的baif-r，以闪烁梭菌的基因组dna为模板，经pcr扩增获得。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述pcr的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，55℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环。

10.如权利要求7至9中任一权利要求所述的应用，其特征在于：所述胆酸或别胆酸和脱氧氯酰辅酶a的质量比为1-3∶1，所述酶促反应的ph为6-7，温度为30-37℃，转速为150rpm，时间为0.5-1h。

技术总结
本发明公开了一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，首先获得重组表达胆酸辅酶A转移酶基因的质粒，通过重组大肠杆菌高效表达胆酸辅酶A转移酶后，将其应用于转化胆酸或别胆酸，可将胆酸或别胆酸和脱氧氯酰辅酶A混合物转化为胆酰辅酶A或四氯酰辅酶A和脱氧胆酸的混合物，通过分离获得脱氧胆酸，具有酶反应时间短、转化率高和产品纯度高的优势，具备良好的工业化生产应用前景。

技术研发人员：林博,李悦歆
受保护的技术使用者：广东筑美生物医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13