MDCK-21细胞克隆株及利用该细胞克隆株培养H9亚型禽流感病毒的方法与流程

本发明涉及病毒培养，具体地说，涉及mdck-21细胞克隆株及利用该细胞克隆株培养h9亚型禽流感病毒的方法。

背景技术：

1、禽流感(avian influenza，ai)是由a型禽流感病毒(avian influenza virus，aiv)感染家禽后引起的各种综合征。禽流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属。血凝素(hemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(nueraminidase，na)是病毒的两种主要保护性抗原，根据ha、na的抗原性差异，可将a型流感病毒分为不同亚型。现已发现的a型禽流感病毒的ha有16种，分别为h1～h16，na有10种，分别为n1～n10，各种亚型的a型流感病毒均能感染家禽，不同h抗原或n抗原之间无交叉反应。aiv根据其致病性可分为高致病性aiv，主要为h5、h7；低致病性aiv，主要为h9。

2、我国目前生产的h9亚型禽流感灭活疫苗大多采用鸡胚作为病毒生长载体，生产成本高，难以应对急性大规模的禽流感流行。尽管有少数厂家采用贴壁mdck细胞培养方法制备禽流感疫苗，但单细胞层培养体系中细胞的增殖受到基质表面积的限制，很难实现大规模培养，消化过程也增加了工艺的复杂性、生产时间和成本。全悬浮培养可以突破细胞生长表面的限制，节约设备空间，有利于大规模生产，并且能够有效降低生产成本。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供mdck-21细胞克隆株及利用该细胞克隆株培养h9亚型禽流感病毒的方法。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于全悬浮培养h9亚型禽流感病毒的mdck-21细胞克隆株的构建方法，将来自人siat7e基因如seq id no:1所示的序列以及来自人st6gal1基因如seq id no:2所示的序列，通过质粒导入mdck细胞中或通过基因工程手段整合到mdck细胞染色体上，筛选得到阳性细胞克隆，经全悬浮无血清培养基传代及驯化，即得。

3、第二方面，本发明提供按照所述方法构建得到的mdck-21细胞克隆株。

4、第三方面，本发明提供mdck-21细胞克隆株qyhzz-mdck-21，即犬肾细胞qyhzz-mdck-21，该细胞株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctcc no：c2022286，保藏日期2022年9月7日。

5、第四方面，本发明提供所述mdck-21细胞克隆株在病毒的全悬浮培养中的应用。

6、优选地，所述病毒为h9亚型禽流感病毒，更优选wf株(保藏编号cgmccno.9459，可参见cn104250637a)。

7、第五方面，本发明提供一种利用mdck-21细胞克隆株(犬肾细胞qyhzz-mdck-21)培养h9亚型禽流感病毒的方法，所述方法包括：将所述mdck-21细胞克隆株接种于全悬浮无血清培养基中，再接种h9亚型禽流感病毒进行全悬浮无血清培养，收获病毒液。

8、优选地，所述h9亚型禽流感病毒为wf株。

9、进一步地，接种h9亚型禽流感病毒时的细胞密度为8.0×106-10.0×106个细胞/ml。

10、进一步地，h9亚型禽流感病毒的接种量为moi＝0.5-2。

11、进一步地，全悬浮无血清培养的培养条件为：温度36.8-37℃，溶氧45-55％，搅拌转速60-90rpm，ph7.0-7.2。

12、进一步地，在细胞活率降至70％以下，细胞密度降至2×106个细胞/ml以下时，结束培养；培养结束后，将细胞破碎后收集病毒液。

13、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

14、本发明提供的mdck-21细胞克隆株(犬肾细胞qyhzz-mdck-21)能够在全悬浮无血清培养过程中快速增殖，保持较高的细胞活率，在接种禽流感病毒h9亚型wf株后，能够使得病毒快速繁殖，在较短时间内获得较高的病毒ha效价，病毒的ha效价高于鸡胚培养病毒。由该细胞株制备得到的禽流感病毒h9亚型wf株抗原的质量好，经动物免疫试验证明具有较高的免疫原性和安全性。

15、基于上述全悬浮mdck-21细胞克隆株qyhzz-mdck-21，本发明还提供禽流感病毒h9亚型wf株的全悬浮无血清培养方法，该方法能够满足大规模病毒扩增生产的需要，可适用于禽流感病毒h9亚型wf株及其疫苗的规模化生产，有利于降低生产成本和劳动强度，提高生产效率和产能，为细胞源疫苗产业化和规模化生产提供了技术基础。

技术特征：

1.用于全悬浮培养h9亚型禽流感病毒的mdck-21细胞克隆株的构建方法，其特征在于，将来自人siat7e基因如seq id no:1所示的序列以及来自人st6gal1基因如seq id no:2所示的序列，通过质粒导入mdck细胞中或通过基因工程手段整合到mdck细胞染色体上，筛选得到阳性细胞克隆，经全悬浮无血清培养基传代及驯化，即得。

2.按照权利要求1所述方法构建得到的mdck-21细胞克隆株。

3.犬肾细胞qyhzz-mdck-21，其特征在于，保藏编号为cctcc no：c2022286。

4.权利要求2所述mdck-21细胞克隆株或权利要求3所述犬肾细胞qyhzz-mdck-21在病毒的全悬浮培养中的应用。

5.利用mdck-21细胞克隆株培养h9亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求2所述mdck-21细胞克隆株或权利要求3所述犬肾细胞qyhzz-mdck-21接种于全悬浮无血清培养基中，再接种h9亚型禽流感病毒进行全悬浮无血清培养，收获病毒液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述h9亚型禽流感病毒为wf株，其保藏编号为cgmcc no.9459。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，接种h9亚型禽流感病毒时的细胞密度为8.0×106-10.0×106个细胞/ml。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，h9亚型禽流感病毒的接种量为moi＝0.5-2。

9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，全悬浮无血清培养的培养条件为：温度36.8-37℃，溶氧45-55％，搅拌转速60-90rpm，ph7.0-7.2。

10.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，在细胞活率降至70％以下，细胞密度降至2×106个细胞/ml以下时，结束培养；培养结束后，将细胞破碎后收集病毒液。

技术总结
本发明提供MDCK‑21细胞克隆株及利用该细胞克隆株培养H9亚型禽流感病毒的方法。本发明提供MDCK‑21细胞克隆株QYHZZ‑MDCK‑21，保藏编号为CCTCCNO：C2022286。该MDCK‑21细胞克隆株能够在全悬浮无血清培养过程中快速增殖，保持较高的细胞活率，在接种禽流感病毒H9亚型WF株后，能够使得病毒快速繁殖，在较短时间内获得较高的病毒HA效价，制备得到的禽流感病毒H9亚型WF株抗原的质量较好，具有较高的免疫原性和安全性。本发明提供的全悬浮无血清培养方法适用于禽流感病毒H9亚型WF株及其疫苗的规模化生产，为细胞源疫苗的生产提供了技术基础。

技术研发人员：李吉轩,袁野,周蕾蕾,张秀美,岳建新,孙灵睿,陈秋阁,朱昊敏,史亚娟,刘莉,丰素兰,童琳,李浩鹏
受保护的技术使用者：乾元浩生物股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13