一种快速芯片式的支原体检测方法与流程

本申请涉及生物学分子核酸检测的，尤其是涉及一种快速芯片式的支原体检测方法。

背景技术：

1、支原体(mycoplasma)是一类没有细胞壁的原核细胞型微生物，多形性且可通过0.45μm除菌过滤器，是目前已知能在无生命培养基中生长繁殖的最小微生物。

2、自然界常见的20种支原体中，10种与实验室支原体污染密切相关，即精氨酸支原体(mycoplasmaarginini)、口腔支原体(mycoplasmaorale)、鸡败血支原体(mycoplasamgallisepticum)、肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)、关节液支原体(mycoplasmasynoviae)、发酵支原体(mycoplasmafermentans)、猪鼻支原体(mycoplasmahyorhinis)、莱氏支原体(acholeplasmalaidlawii)、螺原体(spiroplasmacitri)、唾液支原体(mycoplasmasalivarium)。作为细胞培养过程中常见的外源性污染物。

3、支原体污染的检测方法较多，但由于临床治疗用细胞制剂终产品不能进行灭菌处理，且目前的支原体检测方法培养法和指示细胞培养法(dna染色法)所需时间较长，在活细胞制剂终产品的快速放行检测中有一定的局限性，因而需要更完善的细胞制剂终产品的支原体检测方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提出了一种快速芯片式的支原体检测方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

3、一种快速芯片式的支原体检测方法，包括以下步骤：

4、(1)提取反应样品；

5、(2)配置qpcr反应体系，qpcr反应体系包括反应样品、引物探针混合液、基因扩增液以及内部对照ic；

6、(3)将配置完成的qpcr反应体系添加至芯片式反应容器内；

7、(4)芯片式反应容器插入pcr仪器内，进行扩增反应；反应条件为：50℃变性60秒，95℃变性30秒，95℃15秒，60℃25秒，45个循环；反应结束后，得到两组ct值；

8、(5)两组ct值与ic值和pc值进行比较，判断支原体的阴阳性。

9、本发明进一步技术方案设置为，所述引物探针包括pc引物探针和ic引物探针；

10、所述pc引物探针为：

11、mf1：5’-gggagcaaacaggattagataccct-3’；

12、mr1：5’-tgcaccatctgtcactctgttaacctc-3’；

13、mp2：5’-fam-tagtccacgccgtaaacgatgatc-tamra-3’；

14、所述ic引物探针为：

15、mf22：5’-caggtacggctgtcatcacttaga-3’；

16、mr22：5’-catggtgtctgtttgaggttgcta-3’；

17、mp22：5’-cy5-gccctgacttttatgcccagccctg-bhq2-3’。

18、本发明进一步技术方案设置为，所述阳性对照为pc序列克隆到vectorpuc57：

19、gggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgatcattagtcggtgggagccactgacgcagctaacgcattaaatgatccgcctgagtagtatgctcgcaagagtgaaacttaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaatttgaagatacgcggagaaccttacccactcttgacatcctttgcaaagctatagagatatagtggaggttaacagagtgacagatggtgca。

20、本发明进一步技术方案设置为，所述内部对照为ic序列克隆到vectorpuc57：

21、gagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacacttgcttctgacgcaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatggtacacctgactcctgagg。

22、本发明进一步技术方案设置为，所述qpcr反应体系共计15μl，包括：

23、反应样品：3.0-4.0μl；

24、引物探针混合液；1.5-2.5μl；

25、基因扩增液；7.5-9.0μl；

26、内部对照ic；0.5-1.0μl。

27、本发明进一步技术方案设置为，所述qpcr反应体系包括：

28、反应样品；3.0μl；

29、引物探针混合液；1.5μl；

30、基因扩增液；9.9μl；

31、内部对照ic；0.6μl。

32、本发明进一步技术方案设置为，空白对照采用无核酶水。

33、本发明进一步技术方案设置为，阳性对照pc为支原体的特征序列。

34、与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：

35、本发明支原体高保真dna扩增反应体系涉及支原体报告基因的引物探针设计、阳性/内部对照品的设计、扩增反应缓冲液，可以保证高效、快速、稳定的获得支原体的检测结果。

36、本发明检测原理采用双通道荧光taqmanqpcr探针法检测支原体dna，可定性检测细胞及细胞培养的上清液。fam和cy5通道的ct值是否大于40判断结果的阴阳性。

技术特征：

1.一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，所述引物探针包括pc引物探针和ic引物探针；

3.根据权利要求1所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，所述阳性对照为pc序列克隆到vectorpuc57：

4.根据权利要求1所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，所述内部对照为ic序列克隆到vectorpuc57：

5.根据权利要求1所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，所述qpcr反应体系共计15μl，包括：

6.根据权利要求5所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，所述qpcr反应体系包括：

7.根据权利要求1所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，空白对照采用无核酶水。

8.根据权利要求1所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，阳性对照pc为支原体的特征序列。

技术总结
本申请提出了一种快速芯片式的支原体检测方法，包括以下步骤：(1)提取反应样品；(2)配置qPCR反应体系，qPCR反应体系包括反应样品、引物探针混合液、基因扩增液以及内部对照IC；(2)将配置完成的qPCR反应体系添加至芯片式反应容器内；(4)芯片式反应容器插入PCR仪器内，进行扩增反应；反应条件为：50℃变性60秒，95℃变性30秒，95℃15秒，60℃25秒，45个循环；反应结束后，得到两组CT值；(5)两组CT值与IC值和PC值进行比较，判断支原体的阴阳性。本发明支原体高保真DNA扩增反应体系涉及支原体报告基因的引物探针设计、阳性/内部对照品的设计、扩增反应缓冲液，可以保证高效、快速、稳定的获得支原体的检测结果。

技术研发人员：黄懿,姚杰,谢力琦,韩亚平,顾城玮,徐丹丹,吴赛男
受保护的技术使用者：上海探实生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13