一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法

本发明属于基因工程技术及生物，涉及一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法，具体涉及靶向敲除csrp3基因的sgrna及敲除csrp3基因的猪胚胎成纤维细胞的生产方法。

背景技术：

1、扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy，dcm)是一种常见的心肌疾病，其特征是左心室或双心室扩张和收缩功能障碍，每250人中就会有1人患病。dcm的病因可分为遗传性和非遗传性两种，由编码细胞骨架、肌节或核包膜蛋白的的突变基因引起的遗传性dcm约占所有dcm病例的35％。

2、肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，hcm)是一种常见的心血管疾病，其特征是心室壁增厚。hcm可能导致左心室(lv)流出道梗阻、心肌缺血或二尖瓣异常。hcm患者可能出现呼吸困难、胸痛、心悸、晕厥甚至心源性猝死(scd)。

3、csrp3是半胱氨酸和富含甘氨酸的蛋白质3基因(cysteine and glycine-richprotein 3gene)，编码肌肉lim蛋白(muscle lim protein，mlp)，其在心肌生理学和病理学中具有多重作用，包括细胞命运决定、转录调节、细胞粘附和运动、信号转导和细胞骨架组织等。mlp可以与细胞核中的核转录因子myod、肌生成素和肌源调节因子4(mrf4)结合。csrp3突变可导致扩张性心肌病和肥厚型心肌病。mlp缺陷小鼠表现出严重的心功能障碍，例如心脏压力和容量的改变，从而导致扩张性心肌病的发展并伴有肥大和进行性心力衰竭。

4、最近的一项研究表明，hcm病例中csrp3突变的比例高于对照人群，这为csrp3突变确实与hcm相关提供了理论基础。在这里，我们利用crispr/cas9基因编辑技术在猪成纤维细胞中高效实现csrp3基因突变，为csrp3基因突变猪模型的构建、dcm/hcm的研究及药物筛选提供了基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法，构建的细胞系可用于胚胎移植以构建csrp3基因突变猪，为dcm/hcm的研究及药物筛选提供基础。

2、在第一个方面，本发明提供了靶向敲除csrp3基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列为seq id no:1和/或seq id no:2。

3、本发明进一步提供编码所述sgrna的dna分子。

4、本发明进一步提供含有所述dna的载体。

5、例如，可以将所述sgrna通过酶切连接至载体px459上，具体方法为：

6、在csrp3基因第三个外显子的靶点序列gatttcttctgcgtggtaga/gtggtagacggtcttgtcgc的5’端加上bbsi的酶切位点caccg，构成序列caccggatttcttctgcgtggtaga/caccgtggtagacggtcttgtcgc，并人工合成其互补序列aaactctaccacgcagaagaaatcc/aaacgcgacaagaccgtctaccacc，将互补序列caccggatttcttctgcgtggtaga&aaactctaccacgcagaagaaatcc/

7、caccgtggtagacggtcttgtcgc&aaacgcgacaagaccgtctaccacc退火所形成的双链dna分子，与经bbsi酶切的px459载体连接，从而构建表达载体px459-csrp3。

8、在第二个方面，本发明提供了一种敲除了csrp3基因的细胞的构建方法，包括：

9、利用crispr-cas9系统敲除所述细胞的csrp3基因，所述crispr-cas9系统使用的sgrna的核苷酸序列为seq id no:1和/或seq id no:2。

10、进一步地，所述利用crispr-cas9系统敲除所述细胞的csrp3基因中使用px459载体。

11、进一步地，所述细胞为猪胚胎成纤维细胞。

12、在第三个方面，本发明提供了根据如上所述的构建方法构建得到的细胞及其在构建csrp3基因突变动物模型或dcm/hcm药物筛选中的应用。

13、进一步地，所述动物模型为猪模型。

14、本发明的有益效果在于：

15、本发明首次得到csrp3基因敲除猪胚胎成纤维细胞，利用crispr-cas9系统从猪胚胎成纤维细胞中敲除csrp3基因，有效改进了抑制剂、敲低、干扰等特异性不强、基因沉默不彻底等缺点。在疾病模型方面，目前还没有针对csrp3基因敲除的dcm/hcm模型细胞，本申请创新性地构建了在基因组序列水平部分模拟此类疾病的细胞，在后续中，我们可以将此细胞通过胚胎移植技术产生带有csrp3基因敲除的dcm/hcm模型猪，为dcm/hcm药物筛选和临床治疗提供基础。

技术特征：

1.靶向敲除csrp3基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列为seq id no:1和/或seq id no:2。

2.编码权利要求1所述sgrna的dna分子。

3.含有权利要求2所述dna的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为px459。

5.一种敲除了csrp3基因的细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述利用crispr-cas9系统敲除所述细胞的csrp3基因中使用px459载体。

7.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，所述细胞为猪胚胎成纤维细胞。

8.权利要求5-7任一项所述的构建方法构建得到的细胞。

9.权利要求8所述的细胞在构建csrp3基因突变动物模型或dcm/hcm药物筛选中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述动物模型为猪模型。

技术总结
本发明属于基因工程技术及生物技术领域，涉及一种扩张性/肥厚型心肌病基因突变猪成纤维细胞系的构建方法。本发明先设计一种敲除CSRP3基因的sgRNA，将所述sgRNA构建至载体px459后，将表达载体px459‑CSRP3作为CSRP3基因的打靶载体，转染猪胚胎成纤维细胞，获得CSRP3基因敲除的猪胚胎成纤维细胞，得到的多种不同编辑类型的突变体，可造成移码突变，编辑效率高。

技术研发人员：庄乐南,巩倩,刘艳,金佳敏,贺津,王华南
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12