基于微滴式数字PCR的肉制品掺假快速定量鉴别方法

本发明属于肉制品掺假检测，具体涉及一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法。

背景技术：

1、目前，全球的食品安全问题不再围绕着重点污染物对消费者造成的健康威胁，而更多地表现为以食品掺假为主要手段的食品安全事件，该类事件严重威胁到消费者的合法权益。由于肉类的高营养价值和独特的风味，肉类和肉类生产一直是食品掺假贸易的中心。造假者在牛肉和羊肉产品中掺入猪肉、鸡肉和鸭肉等低价肉类，或在精加工肉制品中进行成分稀释、成分替换，以增加经济回报。

2、在鉴定肉制品掺假的方法中，传统的依靠光谱学、免疫学和质谱技术的检测方法，此种方法存在耗时较长，且不能准确量化产品中的异源的问题。另外，现有的标准检测方法均为定性检测或相对定量检测，仅适用于鉴别是否存在某一动物源性成分，当不同的动物源性成分同时检出时，不便于有效区分是生产过程中由于共用容器、设备和生产线造成的“无意添加”，还是以掺假为目的的“有意添加”，且不能将基因拷贝数转化为质量分数，不能满足对不同品种的肉制品掺假成分进行快速鉴别和定量分析。

技术实现思路

1、基于上述技术问题，本发明提供一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，该方案与微滴式数字pcr相结合，通过提取待测样品的dna并与ddpcr反应液混合，进行pcr扩增，得到样品的基因拷贝数，根据ma＝k×qt/qa计算肉制品掺假百分比，从而实现满足不同种类的肉制品掺假成分的快速鉴别和定量分析的作用。

2、其具体技术方案为：

3、一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，包括如下步骤：提取待测样品的dna；将待测样品dna与ddpcr反应液混合，从而形成ddpcr反应体系，且ddpcr为微滴式数字pcr简写；对ddpcr反应体系进行pcr扩增，扩增结束后通过微滴读取仪读取反应中待测样品的基因拷贝数，且待测样品中的目标肉种和掺假肉种的基因拷贝数分别为qt和qa；根据ma＝k×qt/qa计算肉制品掺假百分比；其中，ma表示肉制品掺假肉种质量百分比，k表示倍增系数。

4、另外，本发明提供的上述技术方案中的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法还可以具有如下附加技术特征：

5、在上述技术方案中，ddpcr反应液包括物种特异性引物对、探针、ddpcr预混液和无核酸酶水。

6、在上述技术方案中，pcr扩增步骤为：92-98℃、30-60s，91-97℃、25-35s，55-61℃、55-65s，38-45个循环，96-99℃、9-10min。

7、在上述技术方案中，确定倍增系数k的具体步骤为：测量目标肉种的质量mb和掺假动物源性成分的质量mc；确定目标肉种的基因拷贝数qb和掺假动物源性成分的基因拷贝数qc；根据公式mb/mc＝k×qb/qc得出倍增系数k。

8、在上述技术方案中，还包括：取目标肉种和掺假肉种，按照不同比例混合均匀，从而得到混合样品，以便于后续对混合样品进行检测。

9、在上述技术方案中，还包括：分别检测混合样品中目标肉种与掺假肉种的基因拷贝数，并根据倍增系数k计算得到目标肉种或掺假肉种的含量测定值。

10、在上述技术方案中，还包括：在各个混合样品中混合100mg的火鸡肉作为内标物种，提取dna并进行pcr扩增，从而测得各个物种的靶基因拷贝数。

11、在上述技术方案中，探针的5’端标记有荧光发射基因，探针的3’端标记有荧光淬灭基因。

12、在上述技术方案中：荧光发射基团选自fam、cy5、vic、joe和hex，且荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、tamra和mgb。

13、本发明的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，与现有技术相比，有益效果为：

14、通过以牛、羊、鸡、猪、鸭、火鸡的肉制品为样品，提取样品的dna，将待测样品dna与ddpcr反应液混合，形成ddpcr反应体系，并对该ddpcr反应体系进行pcr扩增，通过微滴读取仪读取反应中样品的基因拷贝数，基于单位质量的动物源性成分基因拷贝数不变的原理，根据ma＝k×qt/qa进行计算，得到肉制品掺假肉种的质量分数，从而利用k值将不同动物源性成分的基因拷贝数比值准确转化为质量分数，进而实现满足不同种类的肉制品掺假成分的快速鉴别和定量分析的作用。

技术特征：

1.一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于：

4.根据权利要求1所述的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于，确定倍增系数k的具体步骤为：

5.根据权利要求1所述的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于，还包括：

6.根据权利要求5所述的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于，还包括：

7.根据权利要求6所述的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于，还包括：

8.根据权利要求1所述的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于：

9.根据权利要求8所述的一种基于微滴式数字pcr的肉制品掺假快速定量鉴别方法，其特征在于：

技术总结
本发明提供了一种基于微滴式数字PCR的肉制品掺假快速定量鉴别方法，所属肉制品掺假检测技术领域，包括：提取待测样品的DNA；将待测样品DNA与ddPCR反应液混合，从而形成ddPCR反应体系，且ddPCR为微滴式数字PCR简写；对ddPCR反应体系进行PCR扩增，扩增结束后通过微滴读取仪读取反应中待测样品的基因拷贝数，且待测样品中的目标肉种和掺假肉种的基因拷贝数分别为Qt和Qa；该方案通过提取待测样品的DNA并与ddPCR反应液混合，进行PCR扩增，得到样品的基因拷贝数，根据Ma＝k×Qt/Qa计算肉制品掺假百分比，从而实现满足不同种类的肉制品掺假成分的快速鉴别和定量分析的作用。

技术研发人员：何禹璇,闫伟,李飞武,龙丽坤,董立明,李葱葱,夏蔚,邢珍娟,刘娜,谢彦博,马月
受保护的技术使用者：吉林省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13