一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针及其制备方法与应用

本发明属于生物，尤其涉及一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针及其制备方法与应用。

背景技术：

1、多种生物小分子、核酸、蛋白质的同时定性或定量检测对于疾病诊断及生物医学研究等具有重要的科学意义。例如：多种核酸、蛋白质的异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关。分析活细胞中多种肿瘤相关核酸分子的表达水平对其生理病理研究具有重要意义。相对于单一标志物的检测，多种标志物的检测和成像可以提高检测结果的准确性，减少假阳性或假阴性的检测结果，多通路检测和成像对于临床医学来说及其重要。

2、荧光是一种物质在激发态回到基态时伴随的光发射现象，以荧光为输出信号的探针已成为用于分子传感和成像的最强大工具之一，特别是荧光原位杂交(fluorescence insitu hybridization，fish)一直是可视化细胞内dna或rna的主要方法，使直接可视化和实时监控内源性目标分析物在细胞内局部微环境的浓度成为可能。但是基于fish荧光成像的方法需要固定细胞从而破坏细胞，且用于活细胞内分子检测的空间分辨率受限，极大的限制了其在活细胞内分子成像中的应用。

3、近年来，dna纳米技术已经得到了很好的发展，成为一种由前途的强大的技术。由于dna纳米技术的生物安全性、良好的生物相容性、可编程性以及易于合成和修饰的优势，dna框架核酸已被用于一系列生物医学应用，从生物传感、生物成像、诊断到治疗。与传统的dna探针(如线性单链捕获探针、茎环结构探针以及链取代双链探针)相比，框架核酸分子探针具有以下优势：(1)基于框架核酸的分子探针可通过适体、小分子、肽链、抗体以及荧光染料的修饰，实现其功能化；(2)基于框架核酸的分子探针无须特殊的转染试剂，可直接通过胞吞的方式通过细胞膜进入细胞，实现细胞内靶标识别和分析；(3)框架核酸分子在探针内吞过程中表现出较强的稳定性，可有效抵抗细胞内核酶水解；(4)作为天然的生物分子，dna框架核酸分子探针表现出较低的细胞毒性；(5)结合荧光成像技术，可以针对不同的生物分子(如circrna,mirna等)进行灵活设计，有望实现核酸水平的高灵敏检测和超分辨成像。因此，dna框架核酸分子探针在细胞内实现多靶标检测和成像中具有巨大的潜力。

4、传统探针通常基于“一对一”杂交反应对核酸分子进行检测，灵敏度有限，因此，本发明将刺激响应型dna框架核酸纳米探针和催化发夹组装(catalytic hairpin assembly，cha)信号放大技术结合起来，制备了一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针，可用于活细胞中两种核酸分子的同时检测和成像。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针及其制备方法与应用，该核酸纳米探针具有良好的生物相容性和抗核酸酶的稳定性，可用于目标核酸的高灵敏检测，实现细胞内多靶标的同时成像研究。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针，由10条长单链dna互补配对而成，其中包含四个dna发夹结构；所述四个dna发夹结构中的两个dna发夹结构含有目标分子识别域，其余两个dna发夹结构含有切割位点双硫键；含有目标分子识别域的一个dna发夹结构和含有切割位点双硫键的一个dna发夹结构构成一组cha反应组件，即四个dna发夹结构构成两组cha反应组件。

3、进一步地，所述10条长单链dna序列选自seq no.1-10；其中，含有目标分子识别域的两个dna发夹结构分别选自seq no.7-8，含有切割位点双硫键的两个dna发夹结构分别选自seq no.9-10，其余6条长单链dna序列选自seq no.1-6。

4、进一步地，所述选自seq no.1-8的8条长单链dna构成dna八面体结构，其中选自seq no.7-8的含有目标分子识别域的两个dna发夹结构分别位于dna八面体结构的顶点上；所述选自seq no.9-10的含有切割位点双硫键的两个dna发夹结构分别位于dna八面体结构的顶点上。

5、进一步地，所述含有目标分子识别域的两个dna发夹结构标记有荧光分子和猝灭基团。

6、进一步地，所述荧光分子和猝灭基团通过共价、嵌入、配位中的任意一种或者多种方法标记。

7、一种上述的核酸纳米探针的制备方法，选自seq no.1-8的8条长单链dna通过程序性降温自组装形成dna八面体结构，其中选自seq no.7-8的两个dna发夹结构含有目标分子识别域；所述程序性降温是指95℃保持10min，然后每3min降1℃缓慢降至4℃；选自seqno.9-10的含有切割位点双硫键的两个dna发夹结构首先在90～100℃保持5～15min后，降温至20～30℃至少2h，使其形成稳定的发夹结构；将所述形成稳定的发夹结构的含有切割位点双硫键的两个dna发夹结构通过链杂交的方式连接到dna八面体结构上，得到刺激响应型dna框架核酸纳米探针；所述链杂交的反应条件为25～37℃，0.5～2h。

8、进一步地，所述选自seq no.1-10的10条长单链dna的摩尔比为1。

9、进一步地，所述链杂交的反应条件为25℃，1h。

10、进一步地，所述刺激响应型dna框架核酸纳米探针的缓冲体系包括tris和mg2+，其中ph为8.0～8.5。

11、上述的核酸纳米探针在细胞内检测多种目标核酸分子和活细胞成像的应用；所述目标核酸分子包括dna和rna。

12、本发明的有益效果是：(1)采用dna材料，利用dna八面体结构多个顶点设计dna序列，连接不同的荧光分子，可同时实现多靶标检测成像，减少或避免假阳性结果；(2)dna纳米材料具有良好的生物相容性，基于框架核酸的分子探针无须特殊的转染试剂，可直接通过胞吞的方式通过细胞膜进入细胞，实现细胞内靶标识别和分析；(3)结合荧光成像技术，可以针对不同的核酸分子(如circrna,mirna等)进行灵活设计，有望实现核酸水平的高灵敏检测和超分辨成像；(4)利用肿瘤细胞内高浓度的还原性物质gsh，设计含二硫键的cha发夹组件通过链杂交反应连接到dna八面体结构上，在目标核酸分子存在下，可通过gsh断裂二硫键释放cha反应组件，引发cha反应，实现信号放大，用于活细胞内相关生物标志物的检测和成像。

13、综上所述，根据本发明提供的一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针的制备方法与应用，解决了现有荧光成像技术检测灵敏度低，操作繁琐，容易出现假阳性信号等问题，根据本发明制备的刺激响应型dna八面体框架核酸纳米探针具有良好的稳定性和生物相容性，在细胞中未见明显的毒性，在细胞成像上具有显著优势，为疾病的早期精准诊断和靶向治疗提供了新思路。

技术特征：

1.一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针，其特征在于，由10条长单链dna互补配对而成，其中包含四个dna发夹结构；所述四个dna发夹结构中的两个dna发夹结构含有目标分子识别域，其余两个dna发夹结构含有切割位点双硫键；含有目标分子识别域的一个dna发夹结构和含有切割位点双硫键的一个dna发夹结构构成一组cha反应组件，即四个dna发夹结构构成两组cha反应组件。

2.根据权利要求1所述的一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针，其特征在于，所述10条长单链dna序列选自seq no.1-10；其中，含有目标分子识别域的两个dna发夹结构分别选自seq no.7-8，含有切割位点双硫键的两个dna发夹结构分别选自seq no.9-10，其余6条长单链dna序列选自seq no.1-6。

3.根据权利要求2所述的一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针，其特征在于，所述选自seq no.1-8的8条长单链dna构成dna八面体结构，其中选自seq no.7-8的含有目标分子识别域的两个dna发夹结构分别位于dna八面体结构的顶点上；所述选自seqno.9-10的含有切割位点双硫键的两个dna发夹结构分别位于dna八面体结构的顶点上。

4.根据权利要求1所述的一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针，其特征在于，所述含有目标分子识别域的两个dna发夹结构标记有荧光分子和猝灭基团。

5.根据权利要求4所述的一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针，其特征在于，所述荧光分子和猝灭基团通过共价、嵌入、配位中的任意一种或者多种方法标记。

6.一种基于权利要求1所述的核酸纳米探针的制备方法，其特征在于，选自seq no.1-8的8条长单链dna通过程序性降温自组装形成dna八面体结构，其中选自seq no.7-8的两个dna发夹结构含有目标分子识别域；所述程序性降温是指95℃保持10min，然后每3min降1℃缓慢降至4℃；选自seq no.9-10的含有切割位点双硫键的两个dna发夹结构首先在90～100℃保持5～15min后，降温至20～30℃至少2h，使其形成稳定的发夹结构；将所述形成稳定的发夹结构的含有切割位点双硫键的两个dna发夹结构通过链杂交的方式连接到dna八面体结构上，得到刺激响应型dna框架核酸纳米探针；所述链杂交的反应条件为25～37℃，0.5～2h。

7.根据权利要求6所述的核酸纳米探针的制备方法，其特征在于，所述选自seq no.1-10的10条长单链dna的摩尔比为1。

8.根据权利要求6所述的核酸纳米探针的制备方法，其特征在于，所述链杂交的反应条件为25℃，1h。

9.根据权利要求6所述的核酸纳米探针的制备方法，其特征在于，所述刺激响应型dna框架核酸纳米探针的缓冲体系包括tris和mg2+，其中ph为8.0～8.5。

10.权利要求1-5任一项所述的核酸纳米探针在细胞内检测多种目标核酸分子和活细胞成像的应用；所述目标核酸分子包括dna和rna。

技术总结
本发明公开了一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针及其制备方法与应用，该核酸纳米探针包括DNA八面体结构和CHA反应组件。CHA组件包括目标分子识别发夹和谷胱甘肽响应发夹。将探针与不同的目标核酸分子孵育后，探针识别域可以与特定的目标核酸分子结合；通过GSH刺激响应，可生物切割CHA反应组件上的双硫键，从DNA八面体结构上游离出来，发生CHA反应，释放目标核酸分子进入下一循环，实现“一对多”信号放大。本发明可实现多种目标核酸分子的同时检测成像，具有检测灵敏度高、检测特异性好等优点，在分子识别、临床诊断、细胞成像等研究中具有良好的应用前景。

技术研发人员：万莹,朱福琳,王跃宇,杨昕宇,张云鹏,邓盛元
受保护的技术使用者：南京理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12