一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs及其应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种抗ⅰ型单纯疱疹病毒的重组sirnas及其应用。

背景技术：

1、ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv1)是一种传染率极高的人α亚科-疱疹病毒。感染hsv1主要导致口唇疱疹，在少数免疫缺陷患者中可导致角膜炎、脑炎等并发症，人群普遍易感(成年人血清阳性率高达85％以上)。该病毒主要通过口对口接触传播，绝大多数人感染hsv1是在儿童时期感染上的，持续终生。当前，hsv1防治方法仍存在重大挑战，尚无特效治疗药物，也无疫苗上市。

2、rnai(rna interference)是指由rna分子介导的基因抑制，rnai在基因功能研究和疾病治疗方面都有广泛的应用，目前已有多种基于rnai的药物获得fda批准或进入临床试验。逐年增加的rna类药物获批数量充分证明了rna疗法的可行性，也说明了rna疗法作为新一代治疗方案正在快速发展当中。

3、rna类新药开发以及rna的功能研究已经掣肘于rna原料的获取。目前用于ncrna研究的rna试剂，主要采用化学或体外转录合成。这些合成方法生产的rna，不仅价格昂贵，而且产率很低。因此，rna疗法的开展，还需新兴生物技术的介入，以大大降低研究/医疗成本。利用重组trna支架在活细胞内生产表达小分子rna已经应用于多个研究领域，取得了良好的发展。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种抗ⅰ型单纯疱疹病毒的重组sirnas。该重组sirnas具有很好的生物学活性，并且能够在体内外显著降低hsv1的病毒滴度，在动物实验中能够显著降低皮肤表面病毒载量，延长动物存活率，且具有产量高、成本低、功能性好等优点。与传统的小分子药物相比，sirna药物可以直接作用于病毒的基因组，利用碱基互补配对原则来干扰病毒mrna表达，显著抑制病毒的复制，降低病毒载量。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗ⅰ型单纯疱疹病毒的重组sirnas，其特征在于，所述重组sirnas的序列为seq id no：1至seq id no：10所示序列中的一种，或者为与seq id no：1至seq id no：10所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。

3、上述的一种抗ⅰ型单纯疱疹病毒的重组sirnas，其特征在于，所述重组sirnas生产过程中以hsv1基因组不同位置为靶点，设计小干扰rna，所述小干扰rna的序列如seq idno：11至seq id no：20所示。

4、进一步地，本发明提供了一种上述重组sirnas在制备具有体外/内降低ⅰ型单纯疱疹病毒滴度，延长动物存活率的基因组试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。

5、更进一步地，本发明提供了一种上述重组sirnas在制备具有抗ⅰ型单纯疱疹病毒活性的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。

6、本发明的抗ⅰ型单纯疱疹病毒的重组sirnas的生产方法，包括以下步骤：

7、步骤一、设计合成嵌合sirnas序列的hsa-mir-34a前体引物；

8、步骤二、利用pbskrnaseph质粒在trna反密码子环处具有的酶切位点，将重组sirnas的前体序列插入pbskrnaseph质粒中，构建表达载体；

9、步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；

10、步骤四、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总rna，以fplc分离纯化目标重组sirnas。

11、本发明以人角质形成细胞(hacat)、人视网膜色素上皮细胞(arpe19)、人神经母细胞瘤细胞(sy5y)为细胞模型，检测了重组sirnas抗hsv1的活性，包括：

12、一、利用表达的重组sirnas在hacat、arpe19、sy5y中进行转染，利用stem loopqpcr技术检测重组sirnas成熟体表达量；

13、二、将重组sirnas在hacat、arpe19、sy5y中进行转染并感染hsv1病毒，利用qpcr技术检测重组sirnas对靶基因的抑制情况；

14、三、将重组sirnas在hacat、arpe19、sy5y中进行转染并感染hsv1病毒，利用空斑法检测重组sirna抗病毒效果；

15、四、在疱疹性皮肤病动物感染模型中，将hsv1滴加在小鼠皮肤上后并连续5天在小鼠皮肤上涂抹柔性脂质体包裹的重组sirnas，评价重组sirnas对小鼠体内病毒载量和保护率的影响。

16、本发明与现有技术相比具有以下优点：

17、1、本发明利用新型trna支架表达的具有生物学活性的sirnas相比于化学合成的sirna，产量高，价格低廉，活性和安全性更高。

18、2、本发明的重组sirnas具有很好的生物学活性，并且能够在体内外显著降低hsv1的病毒滴度，在动物实验中能够显著降低皮肤表面病毒载量，延长动物存活率，且具有产量高、成本低、功能性好等优点。与传统的小分子药物相比，sirna药物可以直接作用于病毒的基因组，利用碱基互补配对原则来干扰病毒mrna表达，显著抑制病毒的复制，降低病毒载量。

19、下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

技术特征：

1.一种抗ⅰ型单纯疱疹病毒的重组sirnas，其特征在于，所述重组sirnas的序列为seqid no：1至seq id no：10所示序列中的一种，或者为与seq id no：1至seq id no：10所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。

2.根据权利要求1所述的一种抗ⅰ型单纯疱疹病毒的重组sirnas，其特征在于，所述重组sirnas生产过程中以hsv1基因组不同位置为靶点，设计小干扰rna，所述小干扰rna的序列如seq id no：11至seq id no：20所示。

3.一种如权利要求1所述重组sirnas在制备具有体外/内降低ⅰ型单纯疱疹病毒滴度，延长动物存活率的基因组试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。

4.一种如权利要求1所述重组sirnas在制备具有抗ⅰ型单纯疱疹病毒活性的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。

技术总结
本发明公开了一种抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的重组siRNAs，所述重组siRNAs的序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种，或者为与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。另外，本发明还公开了该重组siRNAs的应用。本发明的重组siRNAs具有很好的生物学活性，并且能够在体外显著降低Ⅰ型单纯疱疹病毒的滴度，在体内显著降低皮肤表面病毒载量，提高动物存活率，且具有产量高、成本低、功能性好等优点。

技术研发人员：骞爱荣,田野,裴佳伟,李郁,姜山峰
受保护的技术使用者：西北工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12