一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、趋磁细菌(magnetotactic bacteria,mtb)是能在磁场作用下，一类可以进行定向趋磁运动的细菌的总称。趋磁细菌为厌氧或微好氧的革兰氏阴性细菌，有球状、杆状、弧形、螺旋状及多细胞聚集等类型，广泛分布于海洋、淡水等不同地区的地质沉积物中。由于趋磁细菌的遗传操作体系尚不完善,使得在分子水平上研究其遗传学进展缓慢。

2、磁小体是由趋磁细菌在体内产生的一种矿物质晶体，其颗粒均一,有稳定的晶体和磁学性质,表面由双层磷脂包被。磁小体的这些特点使其能够作为多种化合物和生物分子的载体,利用脂膜及其具有的各种基团来连接化合物或锚定蛋白。磁小体生物合成过程主要包括：质膜内陷引发磁小体膜的形成、铁的吸收及转运及磁核的矿化及成熟、磁小体链的有序组装。与人工磁性材料相比,磁小体具有各种优良的特性,能够在免疫磁性分离、检测技术和靶向肿瘤治疗等领域中被广泛应用。

3、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(magnetospirillum gryphiswaldense msr-1)基因组中发现的mamab操纵子对磁小体合成有核心作用。mamab操纵子由18个线性排列的基因组成，长约16.4kb。mama基因产生的蛋白是构成磁小体膜的成分之一，在磁小体的外表面，该基因也可促进磁小体囊泡正确行使功能，同时，mama蛋白的tpr结构使其具有介导蛋白之间相互作用的潜能。mamr基因构成的突变株合成的磁小体较小，形状也有缺陷；mamr可能参与控制磁小体链的大小以及晶体的性质，但与晶型无关。mamp蛋白因含有pdz结构域，有助于它与其它蛋白的相互作用，mamp还是另一个预测含有亚铁血红素的磁小体蛋白，该蛋白与血红素结合后，可能参与一个信号传导途径，按环境的需要决定磁小体合成的数量，mamp基因突变株的合成的磁小体较少，但体积增大。

4、本发明通过对一种磁小体关键基因过表达工程菌株的构建，得到的工程菌株磁螺菌能够显著提高趋磁细菌产生磁小体的能力。

技术实现思路

1、本发明提供了一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用。本发明构建的工程菌株中含有磁小体合成关键基因，且构建方法步骤简单，构建的三个趋磁细菌工程菌株具有显著提高产生磁小体的能力。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种趋磁细菌工程菌株，所述趋磁细菌工程菌株中同时含有磁小体合成关键基因和启动子。

4、进一步的，所述磁小体合成关键基因具有下列核苷酸序列之一：

5、(1)seq id no.1所示的核苷酸序列；

6、(2)seq id no.2所示的核苷酸序列；

7、(3)seq id no.3所示的核苷酸序列；

8、(4)与seq id no.1所示的核苷酸序列、或者seq id no.2所示的核苷酸序列、或者seq id no.3所示的核苷酸序列具有95％以上同源性的，且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

9、进一步的，所述启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示。

10、进一步的，所述趋磁细菌工程菌株能够显著提高产生磁小体的能力。

11、本发明还提供了所述的磁细菌工程菌株的构建方法，其特征在于，其包含以下步骤：

12、(1)提取磁螺菌的基因组；

13、(2)以提取的磁螺菌基因组为模板，扩增得到目的基因和启动子片段；

14、(3)将目的基因和启动子片段进行重叠延伸；

15、(4)将步骤(3)得到的延伸产物和质粒分别进行酶切后，将得到的酶切产物分别进行酶连，得到重组质粒；

16、(5)将步骤(4)的重组质粒转化感受态细胞，得到重组菌株；

17、(6)将重组菌株和野生型磁螺菌进行接合，筛选验证正确的工程菌株，得到磁细菌工程菌株。

18、进一步的，所述步骤(1)中，目的基因具体为核苷酸序列如seq id no.1所示的mama基因、核苷酸序列如seq id no.2所示的mamr基因、或者核苷酸序列如seq id no.3所示的mamp基因。

19、进一步的，所述扩增mama基因的引物的序列为：

20、mam a-f：5'-ccggagatcaatgtctagcaagccgtcgaatatg-3'；mam a-r：5'-cccggtatcgataagcttttagacggccgaacgttcatcg-3'；所述扩增mamr基因的引物的序列为：

21、mam r-f：5'-gccggagatcaatgacctttgttcagggcgccatgg-3'；

22、mam r-r：5'-cccggtatcgataagctttcatcggttcatgtattccac-3'；

23、所述扩增mamp基因的引物的序列为：

24、mam p-f：5'-gccggagatcaatgaatagcaaactcgtcctgc-3'；mam p-r：5'-cccggtatcgataagctttcatcggttcatgtattccac-3'。

25、进一步的，所述启动子为核苷酸序列如seq id no.4所示的pmam dc，其扩增引物序列为：

26、pmam dc-f：5'-ccgctgcaggaattctttaaggggcagagagggaatc-3'；pmam dc-a-r：5'-ctagacattgatctccggcaagtgtatgcac-3'；或者pmam dc-r-r：5'-caaaggtcattgatctccggcaagtgtatgc-3'；或者pmam dc-p-r：5'-gtttgctattcattgatctccggcaagtgtatg-3'。

27、进一步的，所述步骤(4)中酶连时，所述延伸产物和质粒的酶切产物的体积比为5:2～4:3。

28、本发明还提供了所述的磁细菌工程菌株在免疫磁性分离、检测技术、或者制备靶向肿瘤治疗药物中应用。

29、本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

30、本发明通过基因工程技术，进行了一种磁小体关键基因过表达的工程菌株的构建，得到的工程菌株含有磁小体合成关键基因和启动子基因，其能显著提高产生磁小体的能力；所述构建方法简单，快捷，且开发出的工程菌株，在免疫磁性分离、检测技术和靶向肿瘤治疗等领域中被广泛应用，对于医疗事业具有重要意义。

技术特征：

1.一种趋磁细菌工程菌株，其特征在于，所述趋磁细菌工程菌株中同时含有磁小体合成关键基因和启动子。

2.根据权利要求1所述的趋磁细菌工程菌株，其特征在于，所述磁小体合成关键基因具有下列核苷酸序列之一：

3.根据权利要求1所述的趋磁细菌工程菌株，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示。

4.根据权利要求1所述的趋磁细菌工程菌株，其特征在于，所述趋磁细菌工程菌株能够显著提高产生磁小体的能力。

5.权利要求1所述的磁细菌工程菌株的构建方法，其特征在于，其包含以下步骤：

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，目的基因具体为核苷酸序列如seq id no.1所示的mama基因、核苷酸序列如seq id no.2所示的mamr基因、或者核苷酸序列如seq id no.3所示的mamp基因。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述扩增mama基因的引物的序列为：

8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述启动子为核苷酸序列如seq idno.4所示的pmam dc，其扩增引物序列为：

9.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中酶连时，所述延伸产物和质粒的酶切产物的体积比为5:2～4:3。

10.权利要求1-4任一项所述的磁细菌工程菌株在免疫磁性分离、检测技术、或者制备靶向肿瘤治疗药物中应用。

技术总结
本发明公开了一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用。所述趋磁细菌工程菌株中同时含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、或者SEQ ID NO.3所示的磁小体合成关键基因和如SEQ ID NO.4所示的启动子，该趋磁细菌工程菌株构建对提高磁小体数量有显著影响，且其构建方法步骤简单，安全性高，开发出的工程菌株，能够在免疫磁性分离、检测技术和靶向肿瘤治疗等领域中被广泛应用，对于医疗事业具有重要意义。

技术研发人员：杨建明,梁波,王慧,王兆宝,汤若昊,李美洁
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12