一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量的方法

本发明涉及藻类生物，更具体地说，是一种用2种合成植物生长调节剂协同提高裂壶藻dha含量和产量的方法。

背景技术：

1、dha作为一种具有多种特殊生理功能的营养物质，对人体心血管健康、大脑发育及视力保健等发挥着重要的作用，在医药和食品行业具有广泛的应用前景。dha传统来源是深海鱼油，随着海洋资源的日益枯竭，且从深海鱼油中提取dha具有成本高、腥味重、胆固醇高等缺点，因此需要寻找可持续生产dha的替代资源，当前利用生物发酵法合成dha既环保又可再生和人为调控，已成为当前研究热点。

2、裂壶藻(schizochytrium)，是属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类海洋真菌。裂壶藻具有生长周期短、不占用耕地、养殖不受季节气候影响，且藻油dha含量高、而备受关注，被认为是具有实现dha的可持续商业化生产的潜力菌株之一。目前有许多策略促进裂壶藻中dha积累，非生物胁迫(低温、营养成分缺乏、高盐等)是促进dha含量提高的常用策略，但非生物胁迫使裂壶藻生物量显著降低，致使裂壶藻的dha产量提高并不显著。植物生长调节剂为人工合成的植物激素类似物，具有调控植物的生长过程和细胞活性的功能。中国发明cn 102304479 a研究证实植物激素能促进裂壶藻dha含量和产量增加，然而，dha的含量并不高，不利于产业化生产。

技术实现思路

1、针对现有策略对裂壶藻中dha含量和产量提升能力不足，不利于产业化生产的技术问题，本发明提供一种用2种合成植物生长调节剂协同提高裂壶藻dha含量和产量的方法，在裂壶藻发酵培养时同时添加2种植物生长调节剂己酸二乙胺基乙醇酯(da-6)和2,4-二氯萘氧乙酸(2,4-d)，发挥良好的协同作用，促进裂壶藻中dha积累，提高dha的含量和产量。

2、为了上述目的，本发明的技术方案为：

3、一种用2种合成植物生长调节剂协同提高裂壶藻dha含量和产量的方法，包括如下步骤：

4、(1)以平板涂布活化裂壶藻，以种子培养基培养裂壶藻到对数期，收集藻液作为种子培养液接种至发酵培养基；

5、(2)裂壶藻在添加了0～1.0mg/l da-6的发酵培养基中发酵培养，以dha含量为指标，确定da-6的最佳添加浓度；

6、(3)继续以dha含量为指标，以步骤(2)确定的da-6浓度为基础，确定2,4-d的最佳添加浓度，构建2种合成植物生长调节剂协同诱导裂壶藻dha积累、提高dha含量和产量的稳定培养体系。

7、进一步地，裂壶藻采用的种子培养基的配方为：葡萄糖25.00～35.00g/l，酵母粉4.00～12.00g/l，海水晶15.0～25.00g/l；发酵培养基的配方为：葡萄糖50g/l～100g/l，酵母粉5g/l～30g/l，氯化钠0.1g/l～1g/l，硫酸钾0.5g/l～5g/l，磷酸二氢钾0.1g/l～1g/l，结晶硫酸镁1g/l～10g/l，无水氯化钙0.01g/l～1g/l。

8、进一步地，所述的平板涂布活化裂壶藻具体为：裂壶藻藻种涂布于平板上活化48-72小时，挑取所得单菌落藻株转接至种子液培养基中，于温度为25～30℃，转速为150～200rpm的摇床中培养24～48小时至对数期获得种子培养液，用于接种到发酵培养基用。

9、进一步地，培养用的容器为挡板三角瓶。

10、进一步地，种子培养液以2％～10％的接种比例接种到含有0～1.0mg/l da-6的发酵培养基中，于温度为25～30℃，转速为150～200rpm的摇床中培养48～120小时，收集藻液离心分离获得裂壶藻藻泥，藻泥冷冻干燥后，气相色谱法测定裂壶藻中dha含量，采用内标标准曲线法计算dha含量。以最高dha含量确定da-6最佳添加浓度。

11、进一步地，步骤(3)具体为：在确定da-6浓度的基础上，添加0～2.0mg/l的2,4-d，再以2％～10％的接种比例接种种子培养液，然后于温度为25～30℃，转速为150～200rpm的摇床中培养48～120小时，收集藻液离心分离获得裂壶藻藻泥，藻泥冷冻干燥后，气相色谱法测定裂壶藻中dha含量，采用内标标准曲线法计算dha含量。以最高dha含量确定2,4-d的最佳协同浓度。

12、进一步地，裂壶藻藻粉经皂化和甲酯化后，饱和氯化钠和正己烷萃取dha，气相色谱法测定dha的含量，采用内标标准曲线法计算dha含量。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

14、现有促进裂壶藻dha含量和产量的策略有非生物胁迫、增加氧溶解量、添加植物生长调节剂等。常用的非生物胁迫策略虽提高dha积累但会抑制裂壶藻生长，从而使dha产量提升受到限制，增加溶解氧量需要相应的设备而使养藻成本增加。本发明通过添加合成植物生长调节剂能够显著提高裂壶藻dha含量和产量，且植物生长调节剂使用剂量小，添加到培养基简单方便，合成的植物生长调节剂生产成本低。发明人通过研究和分析，意外发现，da-6和2,4-d这2种植物生长调节剂以适当浓度配合使用，能够发挥明显的协同作用，相比使用单一植物生长调节剂，裂壶藻的dha含量和产量提高倍数明显更大。因此，本发明通过添加2种合成植物生长调节剂协同提高裂壶藻dha含量和产量，是一种相对比较经济合算的策略，更符合工业生产需求。

技术特征：

1.一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于：种子培养基的配方为葡萄糖25.00～35.00g/l，酵母粉4.00～12.00g/l，海水晶15.0～25.00g/l；发酵培养基的配方为葡萄糖50g/l～100g/l，酵母粉5g/l～30g/l，氯化钠0.1g/l～1g/l，硫酸钾0.5g/l～5g/l，磷酸二氢钾0.1g/l～1g/l，结晶硫酸镁1g/l～10g/l，无水氯化钙0.01g/l～1g/l。

3.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：裂壶藻藻种涂布于平板上活化48-72小时，挑取所得单菌落藻株转接至种子培养基中培养24～48小时至对数期得到种子培养液。

4.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于：培养用的容器为挡板三角瓶。

5.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于：种子培养液接种至发酵培养基的接种比例为2％～10％。

6.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于：裂壶藻发酵培养条件为温度25～30℃，转速150～200rpm。

7.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：发酵培养基中添加0～1.0mg/l da-6，于摇床中培养48～120小时，收集藻液离心分离获得裂壶藻藻泥，藻泥冷冻干燥后测定裂壶藻中dha含量，以最高dha含量确定da-6最佳添加浓度。

8.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：发酵培养基中添加步骤(2)确定的da-6最佳浓度，再添加浓度范围在0～2.0mg/l的2,4-d，于摇床中培养48～120小时，收集藻液离心分离获得裂壶藻藻泥，藻泥冷冻干燥后测定裂壶藻中dha含量，以最高dha含量确定2,4-d最佳添加浓度。

9.根据权利要求7或8所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻dha含量和产量的方法，其特征在于：裂壶藻藻粉经皂化和甲酯化后，饱和氯化钠和正己烷萃取dha，气相色谱法测定dha的含量，采用内标标准曲线法计算dha含量。

技术总结
本发明公开了一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量的方法。该方法具体包括：1)以平板涂布活化裂壶藻，以种子培养基培养裂殖藻到对数期，收集藻液作为发酵用种子液；2)以DHA含量为指标，先优化发酵培养基中DA‑6添加浓度；3)继续以DHA含量为指标，再在优化好的DA‑6浓度基础上，优化发酵培养中2,4‑D的添加浓度，构建2种合成植物生长调节剂协同诱导裂壶藻DHA、提高DHA含量和产量的稳定培养体系。本发明通过同时添加2种合成植物生长调节剂DA‑6和2,4‑D，协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量，为工业化生产DHA开辟新途径和提供依据。

技术研发人员：唐裕芳,杨雨欣,曾彦霖,李玉芹,周蓉
受保护的技术使用者：湘潭大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12