一种长春鳊性别特异分子标记与应用

本发明属于鱼类遗传学领域，具体涉及一种长春鳊性别特异分子标记与应用。

背景技术：

1、鱼类的性别决定机制研究被认为是进化生物学的热点问题之一，具有重要的理论和实践意义，备受生物学家的关注。硬骨鱼类是古老的脊椎动物，具有复杂多样的性别决定系统(devlin rh,nagahama y.sex determination and sex differentiation in fish:an overview of genetic,physiological,and environmentalinfluences.aquaculture.2002；208(3–4):191–364)。因此，对鱼类性别决定的研究将有助于了解脊椎动物性别决定的进化。当前性别决定系统的研究主要有三种方法：细胞遗传学方法、育种实验和发掘性别特异性分子标记(gamble t,zarkower d.identification ofsex-specific molecular markers using restriction site-associateddnasequencing.mol ecol resour.2014；14(5):902–913)。其中细胞遗传学方法局限于大多数物种缺乏异形的性染色体；而育种实验的对象主要集中在具有成功育种技术的物种。因此，鉴定性别特异性分子标记被认为是研究物种性别决定遗传基础的有力方法。

2、长春鳊(parabramis pekinensis)隶属于鲤科(cyprinidae)鳊属(parabramis)，又名长身鳊、草鳊等，常见于中国各地江河、湖泊中。长春鳊一般生活在水体中、下层，是草食性鱼类，由于其生长迅速、适应性强、饵料来源广、群体产量高，适合在池塘、水库和湖泊等水域养殖。因其食用味道鲜美、肉质嫩滑、蛋白质含量高，深受消费者的喜爱，是淡水鱼中的佳品。

3、当前许多养殖鱼类的雄性和雌性之间有明显的表型差异，如身体大小和生长速度。例如尼罗罗非鱼的雄性个体比雌性个体生长快，而海鲈鱼和虹鳟鱼等的雌性个体比雄性个体生长快又大。大部分鱼类在性成熟阶段或直至成年才能进行性别鉴定，这极大阻碍了早期鱼类的性别识别。长春鳊雌性比雄性生长速度快10-15％，长春鳊的性别控制育种研究尚未见报道。因此，开发快速、经济和准确可靠的性别鉴定分子生物学方法，对于了解人工养殖物种的生殖生物学和决定性别差异的遗传因素，以及指导人工育种都具有重要的意义。开发长春鳊性别特异性的分子标记，对长春鳊性别控制育种或分子标记辅助育种等育种研究和实践都有重要意义。

4、简化基因组测序是近几年发展起来的将限制性内切酶和高通量测序结合的一种技术。它利用不同的限制性内切酶，在基因组dna的特异切口进行酶切，富集酶切片段后以此为模板，构建高通量测序文库并进行测序，最终获得大量酶切片段的序列。该方法极大降低了基因组的复杂度，成本较低，目前已经成为一种通用而高效的分型方法(davey,j.w.etal.genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generationsequencing.nat rev genet.2011.12,7 499-510)。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术无鉴定长春鳊性别的便捷方法，提供一种长春鳊性别特异分子标记与应用。本发明能够准确鉴定长春鳊的遗传性别，为批量鉴定长春鳊性别奠定技术基础。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、本发明长春鳊性别特异分子标记的开发方法包括如下步骤：

4、(1)雄性长春鳊特异短序列的鉴定

5、利用已知性别的5雌5雄长春鳊为样品，剪尾鳍用于提取总dna，按照2b-rad方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序。对测序数据进行过滤之后，使用stacks v1.31进行性别特异序列鉴定，得到一个序列在5尾雄性长春鳊中全部出现，但是在5尾雌性长春鳊中没有出现，此序列即雄性长春鳊特异短序列，其核酸序列如seq id no.1所示。

6、(2)雄性长春鳊基因组测序

7、步骤(1)中鉴定到的短序列仅有32bp，无法进行普通pcr引物设计，因此需要更长的基因组序列。于是对5尾雄性长春鳊中的一尾进行高通量全基因组测序，然后使用soapdenovo v1.2.0软件进行从头组装，获得雄性长春鳊全基因组序列。

8、(3)将(1)中获得的雄性长春鳊特异短序列在(2)中获得的雄性长春鳊全基因组序列中进行blast搜索，获得一条450bp的长序列，此序列的核酸序列如seq id no.2所示。

9、一种长春鳊性别特异分子标记，其为雄性长春鳊基因组中含seq id no.1所示序列的一段序列。

10、在一些实施方案中，所述的长春鳊性别特异分子标记的核苷酸序列如seq idno.2所示。

11、一种引物，其能够扩增所述长春鳊性别特异分子标记的全长或部分。

12、在一些实施方案中，所述的引物的序列如下：f：ccttcaatgctcatccat(seqidno.3)，r：ttgttgctttccgtgagt(seq id no.4)。

13、上述长春鳊性别特异分子标记或引物在鉴定长春鳊性别中的应用。

14、一种鉴定长春鳊性别的方法，包括如下步骤：提取待检长春鳊的基因组dna，使用上述引物进行pcr扩增，若能扩增出特异性片段则待检长春鳊的性别为雄性，扩增不出特异性片段则待检长春鳊的性别为雌性。

15、所述的方法中，剪取待检长春鳊的尾鳍提取基因组dna。

16、所述的方法中，所述的引物的序列如seq id no.3和4所示时，扩增的特异性片段的长度为450bp。

17、上述长春鳊性别特异分子标记在长春鳊育种中的应用。

18、本发明的优点和有益效果：本发明的分子标记、引物可作为长春鳊性别遗传鉴定的有力工具，具有准确、高效、简便等优点。

技术特征：

1.一种长春鳊性别特异分子标记，其特征在于：所述的分子标记为雄性长春鳊基因组中含seq id no.1所示序列的一段序列。

2.根据权利要求1所述的长春鳊性别特异分子标记，其特征在于：所述的分子标记的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.一种长春鳊性别特异分子标记的开发方法，其特征在于：包括如下步骤：

4.一种引物，其特征在于：所述的引物能够扩增权利要求1或2所述长春鳊性别特异分子标记的全长或部分。

5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于：所述的引物的序列如seq id no.3、seqidno.4所示。

6.权利要求1或2所述的长春鳊性别特异分子标记在鉴定长春鳊性别中的应用。

7.权利要求4或5所述的引物在鉴定长春鳊性别中的应用。

8.一种鉴定长春鳊性别的方法，其特征在于：包括如下步骤：提取待检长春鳊的基因组dna，使用权利要求4或5所述的引物进行pcr扩增，若能扩增出特异性片段则待检长春鳊的性别为雄性，扩增不出特异性片段则待检长春鳊的性别为雌性。

9.根据权利要求8所述的鉴定长春鳊性别的方法，其特征在于：所述的引物的序列如seq id no.3、seq id no.4所示时，扩增的特异性片段的长度为450bp。

10.权利要求1或2所述的长春鳊性别特异分子标记在长春鳊育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种长春鳊性别特异分子标记与应用，属于鱼类遗传学领域。本发明利用2b‑RAD高通量测序方法得到雄性长春鳊特异短序列，通过和雄性长春鳊全基因组序列比对，获得长春鳊雄性特异性的性别鉴定分子标记，其序列如SEQ ID NO.2所示。本发明可作为长春鳊性别遗传鉴定的有力工具，具有准确、高效、简便等优点。

技术研发人员：周小雨,童金苟,俞小牧,陈庚,王俊如,武艳红
受保护的技术使用者：中国科学院水生生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11