用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒与流程

本发明涉及基因检测，特别是涉及一种用于检测脑脊液病原微生物的多重引物组、方法、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、中枢神经系统(cns)感染表现为中枢神经系统或周围神经系统共同或分别遭到不同生物性病原体的入侵，从而引发的一系列神经组织损伤与临床症状，包括脑膜炎、脑炎和精髓炎等疾病。除了死亡率高，中枢神经系统感染会导致永久性残疾，严重影响患者的生活质量和生命安全。包括细菌、病毒，真菌和寄生虫在内的多种微生物，都会引起脑膜炎和脑炎，且许多感染的临床表现都是非特异性的。而传统诊断方法，如血清和脑脊液的培养及涂片染色等检测的阳性率仅有10％左右，无法满足临床需求。而早期快速准确的诊断病原体对于中枢神经系统感染的及时治疗、降低病死率和致残率十分重要。因此，亟需一种新的技术以提高中枢神经系统感染的诊断。

2、近几年来，基于宏基因组技术的病原检测正在加速临床应用与转化，将感染性疾病的诊断带入了“测序”时代。宏基因组学下一代测序(mngs)技术的出现，为人体活检样本和体液(血液、脑脊液、尿液等)中病原微生物的研究提供了重要的数据信息。mngs可以同时对数十亿个dna片段进行独立测序,能够通过一次测定即可识别鉴定出潜在原因的全面微生物，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。与临床上传统培养方法相比，mngs具有更高的敏感性，且大大缩短了样本的检测时间。虽然mngs在临床样本的病原检测具有众多的优势，但其技术仍面临着一些挑战：1)临床样本中的人源核酸背景高，会干扰病原微生物的检出；2)对于胞内菌与真菌等微生物，其检测的灵敏性较低；3)检测成本较高。

3、病原靶向测序通过超多重引物扩增(mpcr)与高通量测序两种技术的结合，在降低实验成本的基础上，能够对临床待测样本中几十种至几百种已知病原微生物进行检测且不受人源背景的干扰，可提高产品的时效性和灵敏度，是解决目前临床病原体诊断领域诸多问题的一种非常有效的补充手段。

技术实现思路

1、本发明提供一种用于检测脑脊液病原微生物的多重引物组与方法，能够精准覆盖40种可导致中枢神经系统感染的常见病原，靶向扩增目标序列，放大病原体的信号，具有较高的灵敏度与特异性，可实现病原体更为精准的广谱检测。

2、用于检测脑脊液病原的多重引物组，包括用于特异性扩增以下病原微生物基因组编码区序列：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特菌、结核分枝杆菌复合群、黄曲霉、新型隐球菌、白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌、格特隐球菌、烟曲霉、克氏锥虫、蓝氏贾第鞭毛虫、卡氏棘阿米巴、溶组织阿米巴、福氏耐格里属阿米巴、小隐孢子虫、刚地弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、猪肉绦虫、马来丝虫、班氏丝虫、广州管圆线虫、卫氏并殖吸虫、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒3、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、eb病毒。

3、多重引物组如seq id no:1-272所示序列工，或者具有相同功能的序列。

4、所述的具有相同功能的序列是指具有90％以上的碱基序列相同。

5、检测脑脊液病原微生物的方法，包括如下步骤：

6、获得脑脊液样本，并采用上述的多重引物组进行多重pcr反应；

7、反应产物经过末端修复、加a、加接头处理后，获得检测文库，并进行ngs测序。

8、所述的多重pcr反应中的反应体系包括：dna模板9μl，包含多重引物组的工作液6μl，hg multiplex pcr master mix 15μl，总体积30μl。

9、有益效果

10、本发明的用于检测脑脊液病原微生物的方法，通过设计特定病原微生物基因片段的特异性引物，靶向扩增物种的目标序列，能够实现病原体的信号放大，有效降低背景核酸对于后续ngs检测结果的影响。该方法可操作性高，能够在同一个反应体系中一次性检测覆盖中枢神经系统感染的40种常见病原，提高mngs对于脑脊液中病原微生物的灵敏度和特异性，具有良好的应用价值。

技术特征：

1.用于检测脑脊液病原的多重引物组，其特征在于，包括用于特异性扩增以下病原微生物基因组编码区序列：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特菌、结核分枝杆菌复合群、黄曲霉、新型隐球菌、白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌、格特隐球菌、烟曲霉、克氏锥虫、蓝氏贾第鞭毛虫、卡氏棘阿米巴、溶组织阿米巴、福氏耐格里属阿米巴、小隐孢子虫、刚地弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、猪肉绦虫、马来丝虫、班氏丝虫、广州管圆线虫、卫氏并殖吸虫、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒3、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、eb病毒。

2.根据权利要求1所述的用于检测脑脊液病原的多重引物组，其特征在于，多重引物组如seq id no:1-272所示序列工，或者具有相同功能的序列。

3.根据权利要求2所述的用于检测脑脊液病原的多重引物组，其特征在于，所述的具有相同功能的序列是指具有90％以上的碱基序列相同。

4.检测脑脊液病原微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：获得脑脊液样本，并采用上述的多重引物组进行多重pcr反应；反应产物经过末端修复、加a、加接头处理后，获得检测文库，并进行ngs测序。

5.根据权利要求4所述的检测脑脊液病原微生物的方法，其特征在于，所述的多重pcr反应中的反应体系包括：dna模板9μl，包含多重引物组的工作液6μl，2×hgmultiplex pcr master mix 15μl，总体积30μl。

6.根据权利要求4所述的检测脑脊液病原微生物的方法，其特征在于，多重引物组扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性20s；60℃退火2min；扩增40个循环；72℃延伸5min。

7.根据权利要求4所述的检测脑脊液病原微生物的方法，其特征在于，末端修复和加a步骤中，反应程序是：4℃下1min，20℃下15min，65℃下15min。

8.一种试剂盒，其特征在于，其中包含有权利要求1-3任一项所述的多重引物组。

技术总结
本发明公开了一种用于检测脑脊液病原微生物的多重引物组、方法、试剂盒及其应用，属于微生物检测技术领域。该发明特异性检测脑脊液样本中40种重要的病原，包括13种细菌、6种真菌、15种寄生虫和6种DNA病毒，精准覆盖中枢神经系统感染的常见病原，提高了脑脊液样本中病原微生物检测的灵敏度和特异性，实现病原体更为精准的广谱检测。

技术研发人员：邵阳,刘佳,赵忞超,那成龙,刘思思,崔月利,郭垚,吴卫卫,蒋文
受保护的技术使用者：迪飞医学科技（南京）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12