一种猕猴桃愈伤原生质体高效分离的方法及其在亚细胞定位中的应用

本发明涉及植物细胞学，尤其涉及一种猕猴桃愈伤原生质体高效分离的方法及其在亚细胞定位中的应用。

背景技术：

1、原生质体是指植物细胞中除去细胞壁的裸露部分，其可直接摄取外源的dna、细胞器、病毒、质粒等，是进行遗传转化研究的理想受体。利用原生质体融合也即体细胞杂交可以克服远缘杂交的不亲和障碍、双亲花期不遇、雌、雄性不育的缺点，在创造新型物种、利用优秀野生资源上有重要的应用前景。自1960年cocking等首次利用纤维素酶粗制剂从番茄根尖分离出大量的原生质体以来，陆续在拟南芥(arabidopsisthaliana)、烟草(nicotianatabacuml.)、葡萄等模式植物中建立了原生质体分离体系。在马铃薯(solanumpapita)原生质体分离的基础上还建立了植物遗传转化及再生体系。在甜樱桃中建立了原生质体分离体系，并以gfp为报告基因获得了转化率84.1％的原生质体瞬时表达系统。在木本植物中植物瞬时表达是一种将目标基因转入靶细胞，并在短时间内使外源基因高效表达的技术。植物原生质体中进行瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到靶细胞基因组中，被广泛应用于蛋白的亚细胞定位、基因瞬时表达、蛋白质互作、启动子活性等多种植物基因功能研究中。此外通过瞬时表达技术，将cas9蛋白和sgrna转入苹果和葡萄的原生质体中，对葡萄mlo-7基因和苹果的dipm1、dipm2和dipm4基因进行了编辑，并通过测序确定了相关基因发生突变。

2、猕猴桃属于猕猴桃科(actinidiaceae)猕猴桃属(actinidialindl)，为雌雄异株多年生落叶藤本果树。原生质体高效分离与瞬时表达技术虽然在拟南芥、番茄、水稻等模式植物中已得到广泛应用，然而在猕猴桃中的相关应用及报道较为罕见。高效的猕猴桃原生质体分离与应用技术不仅是剖析猕猴桃基因功能、基因编辑技术和分子遗传育种的有力策略，而且解决了在模式植物原生质体中异源表达猕猴桃基因所带来的潜在错误定位与功能干扰。因此，建立起高效的猕猴桃原生质体培养及融合技术体系，对后续栽培猕猴桃抗溃疡病资源创新和新品种选育有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种猕猴桃愈伤原生质体高效分离的方法及其在亚细胞定位中的应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种猕猴桃愈伤组织原生质体的制备方法，包括以下步骤：(1)愈伤组织和酶解液按照1.5～2g:10ml的比例混合进行酶解；所述酶解液包括15～25mm4-吗啉乙磺酸、15～25mmkcl、8～15mmcacl2、0.6～0.8m甘露醇、1.8～2.5wt％纤维素酶和0.4％～0.6wt％离析酶、0.8～1.2vt％bsa、0.03～0.08vt％氨苄、0.03～0.04vt％β-巯基乙醇；

4、(2)过滤酶解后的液体，收集滤液并离心，收集沉淀得原生质体。

5、优选的，所述愈伤组织由猕猴桃组培苗外植体诱导获得，所述外植体为美味无菌猕猴桃组培苗叶片。

6、优选的，所述外植体诱导在愈伤诱导培养基中进行，所述愈伤诱导培养基为包含25～35g/l蔗糖、4～8g/l琼脂、2～4mg/l6-ba和0.3～0.8mg/l2,4-d的ms培养基。

7、优选的，所述继代培养的条件为：23～27℃，湿度70～80％，光照1000-4000lx，光/暗周期16h/8h。

8、优选的，所述继代培养的时间为12～18d。

9、优选的，所述酶解的条件为：23～28℃，50～70rpm；酶解时间为6.5～7.5h。

10、优选的，步骤(2)所述过滤后还包括洗涤重悬的步骤，所述洗涤、重悬所用溶液中包含1～3mm4-吗啉乙磺酸、150～160mmnacl、120～130mm cacl2、3～8mmkcl。

11、优选的，步骤(2)中所述过滤在细胞过滤筛中进行，所述细胞筛孔径为70μm。

12、本发明还提供了所述原生质体瞬时转化的方法，用含甘露醇的peg溶液对其进行转化，所述甘露醇浓度为0.4～0.6m。

13、本发明提还供了利用所述方法获得的原生质体在亚细胞定位中的应用。

14、通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

15、本发明提供的猕猴桃原生质体的提取方法具有周期短、效率高、稳定性和重复性好等优点，利用本发明中的方法分离得到的原生质体数量大、活性高、完整性好克服了现有技术愈伤原生质体分离不完全、破碎且产量低的问题；用peg-ca2+法进行瞬时转化，gfp蛋白的转染效率约为35～48％。本发明建立的原生质体高效分离与瞬时转化体系，不仅可以为植物的生长发育、品质形成与调控等方面的分子机理提供高效稳定的技术手段，还可以克服同源遗传转化周期长、效率低、工作量大等缺点。本发明制备得到的猕猴桃原生质体可应用于亚细胞定位，为今后猕猴桃属植物开展基因功能和分子育种研究奠定了基础。

技术特征：

1.一种猕猴桃愈伤组织原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织由猕猴桃组培苗外植体诱导获得，所述外植体为美味无菌猕猴桃组培苗叶片。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述外植体诱导在愈伤诱导培养基中进行，所述愈伤诱导培养基为包含25～35g/l蔗糖、4～8g/l琼脂、2～4mg/l6-ba和0.3～0.8mg/l2,4-d的ms培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织为继代培养后的愈伤组织，所述继代培养在愈伤继代培养基中进行，所述愈伤继代培养基为包含25～35g/l蔗糖、5～10g/l琼脂、0.8～1.2mg/l2,4-d和0.3～0.8mg/l6-ba的ms培养基。

5.根据权利要求4所述的方法，所述继代培养的条件为：23～27℃，湿度70～80％，光照1000-4000lx，光/暗周期16h/8h；所述继代培养的时间为12～18d。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的条件为：23～28℃，50～70rpm；酶解时间为6.5～7.5h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述过滤后，还包括洗涤、重悬的步骤，所述洗涤、重悬所用溶液中包含1～3mm4-吗啉乙磺酸、150～160mmnacl、120～130mmcacl2、3～8mmkcl。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述过滤在细胞过滤筛中进行，所述细胞筛孔径为70μm。

9.权利要求1～8所述原生质体瞬时转化的方法，其特征在于，用含甘露醇的peg溶液对其进行转化，所述甘露醇浓度为0.4～0.6m。

10.权利要求1～8所述方法获得的原生质体在亚细胞定位中的应用。

技术总结
本发明提供了一种猕猴桃愈伤原生质体高效分离的方法及其在亚细胞定位中的应用，属于植物细胞学领域。在本发明中，猕猴桃原生质体分离的方法为：愈伤组织和酶解液按照1.5～2g:10ml的比例混合进行酶解；所述酶解液中甘露醇的浓度为0.6～0.8M、纤维素酶浓度为1.8～2.5wt％、离析酶浓度为0.4～0.6wt％时，分离得到的原生质体产量最大，活力最高，收获的原生质体产量达到2.8×10<supgt;6</supgt;个·g<supgt;‑1</supgt;FW，原生质体活力高达87％。本发明中猕猴桃原生质体的制备方法为猕猴桃属植物开展基因功能和分子育种研究奠定了基础。

技术研发人员：梁东,夏惠,郭玉琪,何遵珍,邓红红,梁艳,田新博,郎宇旋
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12