一种双壳贝类生长调控基因的功能验证方法

本发明属于双壳贝类rna干扰，特别是一种双壳贝类生长调控基因的功能验证方法。

背景技术：

1、我国是世界第一水产养殖大国，水产养殖产量占世界水产养殖总产量的70％，其中，贝类增养殖是我国水产养殖的支柱产业之一，具有十分重要的产业地位。培育生长快、产量高的优良品种一直是贝类遗传育种的中心目标，也是贝类养殖产业发展的迫切需求。贝类生长调控相关基因的筛查及功能解析可为贝类高产良种培育提供有效的分子工具，从而加快育种进程。目前，双壳贝类生长性状相关基因或者分子标记主要是通过全基因关联分析、数量性状基因位点以及转录组学分析等方法进行筛查获得的。虽然生长相关候选基因的鉴定极大的增强了我们对贝类生长变异遗传基础的理解，但由于绝大多数贝类繁殖周期较长，而且在实验室条件下进行长期养殖和繁育存在困难性，这些生长相关基因的功能验证在双壳贝类中十分受限。

2、侏儒蛤(mulinia lateralis)属于软体动物双壳纲、帘蛤目、蛤蜊科的一种小型埋栖贝类，它具有体型小、生长速度快、世代周期短等优点，而且养殖条件温和，易于在实验室条件下进行人工养殖和繁育，是贝类生长调控基因功能研究的良好实验模型。因此，利用模式贝类侏儒蛤进行生长相关基因的研究可以填补目前在双壳贝类中难以进行生长基因功能验证的研究空白。

3、rna干扰技术是通过dsrna介导的内源特异性mrna转录后沉默机制，该技术是一种功能研究的重要手段，目前广泛应用于哺乳动物、斑马鱼、昆虫、植物等生物体的功能缺失效应研究。但是，rna干扰技术在贝类生长调控基因功能研究上的应用潜力尚不清楚。rna干扰可以通过多种途径实现，常见的方法是体外直接合成双链rna后注射于动物特定组织中，但该方法会对机体产生损伤，而且可能存在引起动物应激反应的风险。因此，在贝类生长功能研究领域，建立一种高效快速制备双链rna而且具有非侵入性的rna干扰方法，是长期开展贝类生长相关功能基因研究的重要基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种双壳贝类生长调控基因的功能验证方法，以弥补现有技术的不足。

2、为了达到上述目的，本发明采取以下的技术方案为：

3、一种双壳贝类生长调控基因的功能验证方法，该方法基于rna干扰方法，选用侏儒蛤作为验证贝类。

4、上述方法具体为：

5、(1)首先筛选双壳贝类生长调控基因，所述双壳贝类选用侏儒蛤；

6、(2)基于所述生长调控基因，即目的基因，构建rna干扰质粒；

7、(3)通过投喂方法进行rna干扰质粒干扰；

8、(4)所述目的基因的表达量检测；

9、(5)侏儒蛤表型变化的统计分析，用以进行功能验证。

10、进一步的，所述步骤(2)中，生长调控基因选为胰岛素样肽ilp基因。

11、进一步的，所述步骤(2)中，构建rna干扰质粒具体为：

12、1)设计引物：首先选择目标干扰片段，再根据选定的干扰片段序列设计正反引物：正向引物是mulilp-rnai-f-xhoi：ccgctcgaggttcaacttccgccgaaaac，反向引物是mulilp-rnai-r-sacii：tccccgcggaatgcccacaagcttatcaa；干扰片段的序列为seq id no:1；

13、2)扩增目标干扰片段：从侏儒蛤组织中提取目标干扰片段的rna，随后反转录成cdna，进行pcr反应，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，目标干扰片段进行回收纯化，对回收产物的浓度进行测定并测序；

14、3)测序合格后进行质粒提取，随后对目标干扰片段和l4440载体分别进行双酶切反应；酶切后的产物用凝胶回收试剂盒纯化后进行电泳检测；

15、4)将上述酶切产物与l4440质粒载体进行连接反应，再将ilp-l4440重组质粒以及l4440空载质粒分别转化ht115(de3)感受态细胞中培养；

16、5)重组质粒的测序检测；

17、6)将上述含有ilp-l4440质粒的e.coli ht115细菌进行培养并诱导其表达dsrna；

18、7)dsrna的检测。

19、进一步的，所述步骤(3)具体为：

20、1)实验分组：选择同一群体、大小均一的同龄侏儒蛤进行干扰实验，共分为2组；其中，空白对照组侏儒蛤投喂小球藻和l4440空载质粒的大肠杆菌、实验组侏儒蛤投喂小球藻和ilp-l4440质粒的大肠杆菌；

21、2)dsrna的制备：菌液进行离心，弃掉上清，然后加入小球藻，得到菌藻混合液；

22、3)投喂实验：实验组和对照组均同时同量投喂小球藻，培养一段时间。

23、进一步的，所述步骤(4)中，对实验组和对照组获得的组织材料进行rna提取并反转录得到cdna，计算实验组和对照组中目的基因表达量差异的显著性。

24、本发明的优点和有益效果：

25、本发明建立了细菌介导的rna干扰技术沉默目的基因，探索了适宜进行生长功能验证的合适侏儒蛤年龄个体。通过基因表达量的检测评估dsrna的有效作用时间，并结合侏儒蛤表型变化来评估该方法的可行性。该方法的建立为今后其他基因在贝类生长过程中的功能研究提供了重要的技术支持。

26、经过实验验证，本发明通过细菌介导的rna干扰技术成功实现了对目的基因的敲降，ilp基因的表达量显著降低了81.4％。而且目的基因沉默后抑制了快速生长的二月龄侏儒蛤的生长，在持续干扰十天后实验组的侏儒蛤壳长和壳宽与对照组相比显著减少了20.5％和18.7％。而对于慢速生长的六月龄侏儒蛤并没有显著的干扰效果。因此，本发明提供了一种可用于模式贝类侏儒蛤进行生长相关基因功能研究的有效方法，并评估了适用于进行生长功能验证的合适侏儒蛤个体。

技术特征：

1.一种双壳贝类生长调控基因的功能验证方法，其特征在于，该方法基于rna干扰方法，选用侏儒蛤作为验证贝类。

2.如权利要求1所述的功能验证方法，其特征在于，该方法具体为：

3.如权利要求2所述的功能验证方法，其特征在于，所述步骤（2）中，生长调控基因选为胰岛素样肽ilp基因。

4.如权利要求2所述的功能验证方法，其特征在于，所述步骤（2）中，构建rna干扰质粒具体为：

5.如权利要求2所述的功能验证方法，其特征在于，所述步骤（3）具体为：

6.如权利要求2所述的功能验证方法，其特征在于，所述步骤（4）中，对实验组和对照组获得的组织材料进行rna提取并反转录得到cdna，计算实验组和对照组中目的基因表达量差异的显著性。

技术总结
本发明提供了一种双壳贝类生长调控基因的功能验证方法，该方法基于RNA干扰方法，选用侏儒蛤作为验证贝类。该方法具体验证以L4440质粒为载体，利用大肠杆菌HT115表达侏儒蛤胰岛素样肽基因的双链RNA（dsRNA），通过对体型小、繁殖周期短、可在实验室条件下快速生长的模式贝类侏儒蛤饲喂饵料和细菌表达的dsRNA，检测基因表达抑制后个体的生长性状变化。结果表明，dsRNA有效降低了靶基因的表达水平，导致侏儒蛤出现显著的生长迟缓。本发明明确了适用于生长相关基因功能研究的合适侏儒蛤月龄阶段，并建立了可快速制备大量dsRNA的方法，具有低成本、高效率的优点。

技术研发人员：胡晓丽,孔令玲,连姗姗,王慧贞,张翔超,孔祥福,包振民
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11