一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用与流程

本申请涉及一种应用于病毒扩增的vero细胞株，具体涉及一种应用于病毒扩增的vero细胞株、其构建方法及应用，例如在病毒扩增，尤其是猪流行性腹泻病毒扩增中的应用，属于生物。

背景技术：

1、vero细胞又称为绿猴肾细胞，是一种非整倍性的非洲绿猴(属名：chlorocebus)肾细胞系，1962年日本千叶大学的安村美博分离正常成年非洲绿猴的肾脏上皮细胞并获得该细胞系。vero细胞是连续的非整倍性细胞系，这意味着它的染色体数目异常，而作为连续细胞系，vero细胞可以经过许多分裂周期而不老化。vero细胞的干扰素分泌功能出现缺陷，与正常的哺乳动物细胞不同，它们在被病毒感染时不会分泌干扰素α/β。然而，它们仍然具有干扰素-α/β的受体，因此当将重组干扰素添加到其培养基中时，它们仍然可以作出反应。目前vero细胞被广泛应用于病毒感染分子机制的研究、疫苗及重组蛋白的生产，并被看作是培养流感疫苗和研究病毒感染分子机制的理想细胞模型。

2、vero细胞可以非常广泛的感染流感病毒，猪流行性腹泻病，还有猿猴空泡病毒、麻疹病毒、风疹病毒、节足动物携带性病毒及腺病毒等；后来被发现也容易感染细菌毒素，包括白喉毒素、不耐热肠毒素和志贺氏样毒素等。

3、猪流行性腹泻病毒(pedv)属于冠状病毒中的alfa冠状病毒属。pedv是引起猪腹泻的重要病原之一，各日龄猪均易感，又以哺乳仔猪危害最大。目前的防治手段以疫苗免疫为主，临床使用的主要为灭活疫苗与弱毒疫苗。灭活疫苗作为主要的疫苗之一，其对病毒的需求量较大。但是，现有技术中猪流行性腹泻病毒增殖滴度还不够高，成本较高。

4、猪流行性腹泻病毒可以在vero细胞上进行复制。通过vero细胞进行猪流行性腹泻病毒扩增，是生产猪流行性腹泻疫苗的主要方式。虽然vero细胞中的干扰素表达具有问题对病毒侵染后的复制影响比较小，但是细胞内依然有多种基因对病毒复制有副作用。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种应用于病毒扩增的vero细胞株、其构建方法及应用，该发明得到的细胞株提高了pedv的增殖滴度，显著降低了成本。

2、为实现前述发明目的，本申请采用的技术方案包括：

3、本申请的一个方面提供了一种应用于病毒扩增的vero细胞株，它是通过将vero细胞株基因序列内stat1和emx2中的两个核苷酸片段敲除后形成。

4、在一个实施例中，所述应用于病毒扩增的vero细胞株是通过将vero细胞株基因序列内stat1和emx2两个核苷酸片段敲除后形成。

5、本申请的另一个方面提供了一种应用于病毒扩增的vero细胞株的构建方法，其特征在于包括：通过扩增测序获取vero细胞基因序列，并采用基因编辑技术对vero细胞基因中的stat1和emx2中的一者或两者实施基因敲除，再经过克隆筛选纯化获得所述应用于病毒扩增的vero细胞株。

6、较为优选的，可以将stat1和emx2共敲除后，再经过克隆筛选纯化获得所述应用于病毒扩增的vero细胞株。

7、在一个实施例中，所述的构建方法具体包括：

8、(1)找到vero细胞stat1基因的靶点，设计对应的靶向sgrna，包括sgrna-stat1-f和sgrna-stat1-r；

9、(2)px459(pspcas9(bb)-2a-puro)v2.0载体用bbs i内切酶酶切，然后与sgrna-stat1-f

10、和sgrna-stat1-r序列退火后形成的双链分子进行连接，得到敲除质粒px459(pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna)v2.0；

11、(3)将所述敲除质粒px459(pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna)v2.0转染入vero细胞，嘌呤霉素加压筛选后，进行单克隆化，经过pcr验证得到stat1应用于病毒扩增的vero细胞株。

12、所述靶点的序列，针对vero细胞基因中stat1(seq id no：nw_023666040.1)设计的基因敲除sgrna的序列为：sgrna-stat1-f：caccgcgtaatcttcaggtatgacc和sgrna-stat1-r：aaacggtcatacctgaagattacgc。

13、(4)找到vero细胞emx2基因的靶点，设计对应的靶向sgrna，包括sgrna-emx2-f和sgrna-stat2-r；

14、(5)px459(pspcas9(bb)-2a-puro)v2.0载体用bbs i内切酶酶切，然后与sgrna-emx2-f和sgrna-emx2-r序列退火后形成的双链分子进行连接，得到敲除质粒px459(pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna)v2.0；

15、(6)将所述敲除质粒px459(pspcas9(bb)-2a-puro-sgrna)v2.0转染入已经敲除了stat1基因的vero细胞，嘌呤霉素加压筛选后，进行单克隆化，经过pcr验证得到应用于病毒扩增的vero细胞株。

16、所述靶点的序列，针对vero细胞基因中emx2(seq id no：nw_023666048.1)设计的基因敲除sgrna的序列为：sgrna-emx2-f：caccgtaggggcgtctactccaacc和sgrna-emx2-r：aaacggttggagtagacgcccctac。

17、在一个实施例中，所述基因编辑技术包括crispr/cas9基因编辑技术。

18、在本发明中，所述生长液都是含有10％胎牛血清的rpmi1640培养基，所述维持液是无血清v-lsm培养基。

19、相较于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：

20、(1)基于crispr/case9技术的stat1和emx2基因敲除方法设计了一段特异的sgrna识别stat1和emx2基因，最终导致其表达异常，其中提供的vero细胞stat1和emx2敲除方法具有很强的实用性。

21、(2)本发明的方法还可以用于其它基因的特异性敲除，具有高效、经济等优势。

22、(3)本发明对stat1和emx2基因的研究，为研发新型抗pedv药物和探寻有效猪腹泻病防控方法提供重要依据。

23、(4)本发明通过vero-stat1-emx2-ko细胞pedv接毒实验，测定病毒滴度，确定stat1和emx2基因具有抑制pedv复制的作用。

24、(5)本发明建立的stat1和emx2敲除的细胞系，提高了pedv的增殖滴度，显著降低了成本，为探索pedv高复制水平的细胞系提供依据，为进一步研究pedv增殖具有重要作用，在pedv疫苗生产中具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种应用于病毒扩增的vero细胞株，其特征在于：它是通过将vero细胞株基因序列内stat1和emx2核苷酸片段敲除后形成。

2.根据权利要求l所述的应用于病毒扩增的vero细胞株，其特征在于：它是通过将vero细胞株基因序列内stat1和emx2中的一个或两个核苷酸片段敲除后形成，优选的两个共敲除。

3.一种应用于病毒扩增的vero细胞株的构建方法，其特征在于包括：通过扩增测序获取vero细胞基因序列，并采用基因编辑技术对vero细胞基因中的stat1和emx2中的一者或两者实施基因敲除，再经过克隆筛选纯化获得所述应用于病毒扩增的vero细胞株。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于具体包括：采用基因编辑技术对vero细胞基因中的stat1和emx2实施基因敲除，再经过克隆筛选纯化获得所述应用于病毒扩增的vero细胞株。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，针对vero细胞基因中stat1设计的基因敲除sgrna的序列为：

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，针对vero细胞基因中emx2设计的基因敲除sgrna的序列为：

7.根据权利要求3-6中任一项所述的构建方法，其特征在于：所述基因编辑技术包括crispr/cas9基因编辑技术。

8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于包括：采用含嘌呤霉素进行首次加压筛选培养后，获取单细胞克隆，并通过pcr扩增测序方式获得所述应用于病毒扩增的vero细胞株。

9.根据权利要求1或2所述应用于病毒扩增的vero细胞株在生产病毒活疫苗或灭活疫苗中的用途。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用所述vero细胞株生产猪流行性腹泻病毒疫苗。

技术总结
本申请公开了一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用。所述Vero细胞株是通过将Vero细胞株基因组中STAT1和EMX2两个基因片段敲除后形成。与现有技术相比，本申请通过将Vero细胞株中的STAT1和EMX2中的两者敲除，使其在应用于猪流行性腹泻病毒等的扩增时，能够显著提高病毒的滴度，在病毒活疫苗和灭活疫苗制备中有广阔应用前景。

技术研发人员：张大鹤,肖龙会,王俊肖
受保护的技术使用者：苏州市沃美生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12