一种UV光响应型两亲性嵌段共聚物及其制备和应用

一种uv光响应型两亲性嵌段共聚物及其制备和应用
技术领域
1.本发明属于核磁共振成像技术领域，具体涉及一种uv光响应型两亲性嵌段共聚物，制备方法，及其在制备
19
f mri诊疗探针中的应用。


背景技术：

2.磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)具有高空间分辨率，无电离辐射的特点，是一种利用磁共振现象获取电信号的新兴成像方式。目前临床上常用的磁共振成像大多是1h mri，一方面受到正常组织背景信号的干扰，另一方面存在质子灵敏度较低的问题，致使1h mri通常需要借助造影剂来增加对比度，提高成像效果。质子造影剂分为t1和t2造影剂，t2造影剂为铁基纳米材料，为负性造影，容易被人体内源性的铁或者血块干扰导致误判。t1造影剂主流是钆基造影剂，容易造成脑沉积、肾源性系统纤维化等疾病。
3.19
f mri是一种具有潜力的mri，相比于1h mri，
19
f mri具有自然丰度高、化学位移对组织局部环境更加敏感且几乎不存在内源性背景干扰等优势，能够得到更为清晰的mri图像以便于疾病的早期诊断。
19
f mri的应用是克服1h mri限制有希望的策略之一，人体组织中的氟含量非常低(可忽略不计)，
19
f mri信号仅来自自身包含的氟原子，这将最大限度地提高图像的对比度，与使用的标准顺磁性物质(钆剂等)相比，氟化造影剂的另一个优点是其无毒性和稳定性，没有分解或释放有毒金属离子的风险。基于此，开发优质的
19
f mri分子探针对于mri诊断意义深远。
4.受控药物输送系统(cdds)克服了传统药物递送系统的许多问题(如：利用率低、选择性差、缓释等)，实现了药物在肿瘤部位的可控、高效以及快速释放。这种“智能材料”可以对生物体的内部环境(如ph、氧化还原、酶等)或外部环境(温度、电/磁、超声、光、等)刺激作出反应。其中，光是一种清洁、无创和有效的刺激源，可通过调节波长、强度、时间和空间实现在病变部位高浓度药物释放。光敏基团(如邻硝基苄基氧)在光裂解型药物递送系统中可以吸收光子能量，导致特定的共价键断裂。在紫外线(uv)或近红外(nir)照射下，通过诱导结构变化而释放药物，已被广泛使用并被验证成为一种理想的光学控制释放方法。
5.本发明利用可逆加成-断裂链转移(raft)聚合技术，具有分子量分布窄、“活性”可控以及分子设计能力强等优点，制备得到uv光响应型含氟两亲嵌段聚合物聚(乙二醇)(peg
100
)-邻硝基苄基氧-聚(2,2,2-三氟乙基丙烯酸酯)(peg
100-onb-b-ptfea
5-100
)，在水溶液中自组装形成纳米胶束，疏水性抗癌药物阿霉素(dox)成功包封在胶束核中。该诊疗探针可同时满足成像及药物控释需求，并且制备简单，重复性高，为集成可控刺激响应、优异成像信号、低生物毒性和良好载药能力的“智能”诊疗探针提供设计思路、理论指导和技术支持。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供一种uv光响应型两亲性嵌段共聚物及其制备方法，本发明的另一个目的是根据所述两亲性嵌段共聚物制备得到的uv光响应型两亲性嵌段共聚物
胶束，本发明还有一个目的是提供一种所述uv光响应型两亲性嵌段共聚物胶束在制备
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f mri诊疗探针中的应用。
7.第一方面，本发明公开一种uv光响应型两亲性嵌段共聚物，其特征在于，所述光响应型两亲性嵌段共聚物结构如式ⅰ所示：
[0008][0009]
其中，m为5-100之间的整数，包括但不限于5、10、20、30、50、100。
[0010]
n为100-200之间的整数，在本发明的最优选实施方式中，所述n为100。
[0011]
第二方面，本发明提供一种uv光响应型两亲性嵌段共聚物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0012]
(1)4-羟甲基-3-硝基苯甲酸和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮混合，利用碳化二亚胺活化，在室温下搅拌反应得到2,5-二氧吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸；
[0013]
(2)2,5-二氧吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸、2-((丁基)羰基)硫代)丙酸溶于有机溶剂中，在0-5℃条件下反应得到2,5-二氧吡咯烷-1-基3-硝基-4-((2-((丙基硫代)羰基硫代)丙酰基)氧基)苯甲酸甲酯；
[0014]
(3)2,5-二氧吡咯烷-1-基3-硝基-4-((2-((丙基硫代)羰基硫代)丙酰基)氧基)苯甲酸甲酯与2-甲氧基乙基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯溶于有机溶剂中，碱性条件下反应过夜，得到raft链转移剂，结构如式ⅱ所示：
[0015][0016]
(4)惰性气体中，以aibn为引发剂，将tfea、raft链转移剂、aibn以摩尔质量比为m：1：0.1的比例溶于有机溶剂中，70-75℃条件下搅拌反应12-24h，得到uv光响应型两亲性嵌段共聚物，m为5-100之间的整数，所述uv光响应型两亲性嵌段共聚物结构如式ⅲ所示。
[0017][0018]
本发明所述的tfea是指结构式为的化合物。
[0019]
优选的，步骤(4)所述的m包括5、10、20、30、50、100，在本发明的最优选实施方式
中，所述m为5或10。
[0020]
上述制备方法中所述的有机溶剂包括dmf、二氯甲烷、三氯甲烷、dmso、丙酮中的一种或两种以上的组合。
[0021]
优选的，步骤(3)所述的碱性条件包括向有机溶剂中加入三乙胺、乙二胺中的一种获得的碱性溶剂。
[0022]
第三方面，本发明提供一种uv光响应型两亲性嵌段共聚物胶束，其特征在于，所述共聚物胶束是通过上述uv光响应型两亲性嵌段共聚物在水溶液中进行自组装得到。
[0023]
第四方面，本发明提供一种uv光响应型两亲性嵌段共聚物载药胶束，其特征在于，所述共聚物载药胶束通过如下方法制备得到：将药物和uv光响应型两亲性嵌段共聚物分别溶于溶剂中，混合，搅拌反应过夜，透析，得到uv光响应型两亲性嵌段共聚物载药胶束。
[0024]
所述药物为对疾病具有治疗作用的化合物，包括但不限于阿霉素(dox)。
[0025]
第五方面，本发明提供一种光响应型两亲性嵌段共聚物、uv光响应型两亲性嵌段共聚物胶束、uv光响应型两亲性嵌段共聚物载药胶束在制备
19
fmri诊断和/或治疗探针中的应用。
[0026]
本发明采用raft聚合反应原理制备得到具有稳定结构和性质的亲水性uv光响应大分子raft链转移剂，之后通过raft聚合制备两亲性嵌段共聚物。所述两亲性嵌段共聚物可通过自组装实现药物包覆，利用光刺激-响应特性在邻硝基苄基基团光分解的作用下将药物释放，以实现精确可控地释放药物的目的，为
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f mri影像研究药物的释放过程提供条件，使其可广泛应用于生物载药、成像、检测等方面，实现无毒副作用、靶向控制释放等特性。
附图说明
[0027]
图1uv光响应型两亲性嵌段共聚物载药胶束的释药过程图。
[0028]
图2光响应嵌段共聚物p1及p2的uv/vis吸收光谱。
[0029]
图3空白胶束(实线)和dox负载胶束(虚线)的粒径分布。
[0030]
图4紫外光照前(空白胶束(a)和载dox胶束(b))和照射后(空白胶束(c)和载dox胶束(d))聚合物胶束的tem图像。
[0031]
图5在37℃的pbs(ph＝7.4)缓冲液中空白胶束(实线)和载药胶束(虚线)随时间增长的稳定性(曲线由上至下表示监测时间逐渐增长)。数据表示三个独立练习的平均值和标准差。
[0032]
图6空白胶束p2b和载药胶束p2b&dox在有(1-15min)或无uv照射(0.196w/cm2，320-480nm)条件下的pcs计数率变化。
[0033]
图7载药胶束在有(20min)或无uv照射(0.196w/cm2，320-480nm)条件下药物释放率的趋势比较。
[0034]
图8纳米颗粒的
19
f nmr和
19
f mri；a)空白胶束的体外1h和
19
f mri图像；b)空白胶束的
19
f nmr谱线(胶束峰右侧为三氟乙酸标定峰)。
[0035]
图9不同浓度的空白胶束孵育48小时后huvec细胞的活力(左为pib，右为p2b)。
[0036]
图10huvec细胞与不同浓度的空白胶束(p2b)及其降解产物孵育48小时后的存活率(左为p2b，右为降解产物)。
具体实施方式
[0037]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038]
实施例1uv光响应型两亲性嵌段共聚物的制备
[0039]
制备流程图如下：
[0040][0041]
s1：邻硝基苄基衍生物的制备
[0042]
(1)4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸的制备
[0043]
4-(溴甲基)-3-硝基苯甲酸(1.01g,3.88mmol)和碳酸钠(2.68g,13.6mmol)溶解在水/丙酮(1:1(v/v),30ml)中回流5h，蒸发丙酮，所得到的水相用乙醚(2
×
15ml)萃取，滴加稀盐酸，直到ph值为1以下形成一种黄色的沉淀物，加入乙酸乙酯(2
×
20ml)重新溶解，水相用乙酸乙酯(3
×
20ml)萃取，有机相用水洗涤(2
×
20ml)，硫酸镁干燥，减压(98％)蒸发干燥，得到微黄色粉末产物。
[0044]
(2)2,5-二氧吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸的制备
[0045]
4-羟甲基-3-硝基苯甲酸(1.00g，5.07mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(702mg,6.08mmol)溶解在dmf(15ml)中，加入edci-hci(1.16g,6.08mmol)，并在室温下搅拌反应2h。加入水，用乙酸乙酯提取3次，有机层用2.8％的硫酸氢钾、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空浓缩，通过二氧化硅层析进行纯化后经真空干燥，得到黄色粉末产物。
[0046]
(3)pabtc-onb的制备
[0047]
2,5-二氧吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸(0.323g,0.90mmol,1.00eq),2-((丁基)羰基)硫代)丙酸(0.69g，2.88mmol，2.62eq)和dmap(0.03g，0.23mmol，0.21eq)溶解于10ml干燥的dcm中，冰浴条件下溶液冷却到0℃，然后按比例加入0.85g盐酸edc，搅拌7h后加入盐酸edc0.1g(盐酸edc总量：0.95g，4.94mmol，4.50eq)，搅拌24h后用20ml ea稀释，用20ml0.5m hcl，20ml 0.1m nahco3，25mlnh4cl洗涤两次，在减压下去除溶剂，在环己烷/ea(95/5-3/2)中柱层析法提纯后经真空干燥产物为黄色油状，为2,5-二氧吡咯烷-1-基3-硝
基-4-((2-((丙基硫代)羰基硫代)丙酰基)氧基)苯甲酸甲酯(pabtc-onb)。
[0048]
s2：raft链转移剂(raft-onb-peg)的合成
[0049]
2,5-二氧吡咯烷-1-基3-硝基-4-((2-((丙基硫代)羰基硫代)丙酰基)氧基)苯甲酸甲酯(2.2mg，4.2μmol)与2-甲氧基乙基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯(nh
2-peg100)(0.49mg，2.1μmol)，三乙胺(0.85mg，8.4μmol)溶解在57ml的二甲亚砜中，该混合物在室温下反应一夜。产物先在乙醚中沉淀3次进行提纯，然后经真空干燥后得到淡黄色粉末。
[0050]
s3：uv光响应型两亲性嵌段共聚物的合成
[0051]
首先确定聚合比例为单体：引发剂：raft试剂＝5：0.1：1，根据投料比聚合物中的理论聚合度为5。具体操作如下：以aibn为引发剂，将tfea、raft-onb-peg、aibn以5/1/0.1的比例加入3ml dmf溶液中，随后置入10ml的反应管中，用橡胶塞密封反应管，利用vacuum freeze thaws(真空冷冻解冻)法除尽反应体系中的气体，最后通入惰性气体氮气，70℃下搅拌反应24h，反应结束后，将产物装入分子量为3500的透析袋中，在烧杯中加入2000ml去离子水透析48h并每隔4h、6h、8h、12h换去离子水，去除体系中的dmf溶液及杂质，最后通过冻干机冻干得到光响应嵌段聚合物peg
100-onb-b-ptfea5。
[0052]
按照同样的方法，以aibn为引发剂，将tfea、raft-onb-peg、aibn按照10/1/0.1的比例混合反应，制备得到光响应嵌段聚合物peg
100-onb-b-ptfea
10
。
[0053]
实施例2uv光响应型两亲性嵌段共聚物载药胶束的制备
[0054]
上述方法合成的uv光响应型两亲性嵌段共聚物peg
100-onb-b-ptfea5、peg
100-onb-b-ptfea
10
能够在水溶液中自组装成胶束，本发明通过透析法制备空白胶束和dox负载胶束，具体方法如下：精确称量dox
·
hcl(5mg)并溶解在dmso(1ml)中，然后加入三摩尔当量的三乙胺(tea)(mw＝101.1，ρ＝0.728)搅拌4h，得到dox碱液。分别精确称量聚合物peg
100-onb-b-ptfea5和peg
100-onb-b-ptfea
10
各50mg，分别溶解在dmso(1ml)中，搅拌直至完全溶解，然后加入dox碱液并搅拌过夜，使用恒压漏斗在剧烈搅拌下滴加到超纯水(15ml)中，将混合液转移至透析袋(分子量截留(mwco＝3.5kda)并在超纯水中透析24小时(每4小时更换一次超纯水)以除去dmso和游离dox。透析结束后，通过滤过膜(0.45μm)过滤并冷冻干燥获得载药纳米胶束。
[0055]
实施例3uv光响应型两亲性嵌段共聚物胶束的制备
[0056]
所述的uv光响应型两亲性嵌段共聚物胶束，简称为空白胶束，制备方法同实施例2，区别仅在没有dox药物的情况下使用相同的程序制备得到。
[0057]
效果验证
[0058]
在下面的实验中，本发明将uv光响应型两亲性嵌段共聚物peg
100-onb-b-ptfea5、peg
100-onb-b-ptfea
10
命名为p1和p2，将由p1和p2通过透析法制备得到的空白胶束命名为p1b和p2b，将负载dox的胶束命名为p1&dox和p2&dox。
[0059]
(1)p1和p2的uv/vis吸收光谱测定
[0060]
通过uv-vis光谱仪(日本日立u-4100)监测光敏聚合物的uv-vis吸光度。在dcm中制备0.075mg/ml聚合物溶液(p1和p2)，并在石英试管中暴露于uv照射(0.196w/cm2，320-480nm)在特定时间段(5-1200s)。结果如图2所示，曲线由上至下表示光照时间延长，左图表示p1的uv/vis吸收光谱，右图表示p2的uv/vis吸收光谱。从图中可以看出p1和p2的吸光度在310nm处显著降低，这与onb基团的分解一致。
[0061]
(2)载药纳米胶束粒径测定
[0062]
将本发明制备得到的p1b和p2b、p1&dox和p2&dox，通过动态光散射仪(dls)测定粒径。使用马尔文公司zetasizer nano zs90仪器进行dls测量。仪器配备有4.0mw he-ne的激光器，工作波长为633nm，探测角度173
°
。通过使用累积量方法分析自相关函数，获得了强度加权平均水动力直径(z平均值)和多分散因子。在开始测量前，在平衡时间为2分钟的情况下，在25℃下对每个样品进行至少三次测量。
[0063]
结果如图3所示，所有纳米粒径均低于100nm，具备被动靶向的潜能。并且粒径大小随着疏水链长度的增加而增加，所有纳米粒径分布均呈正态分布，表明纳米结构单分散分布。与空白纳米胶束相比，负载dox的粒径略有增加，但粒径分布保持不变，表明dox有效地填充到胶束中，并在一定程度上增加了粒径。
[0064]
(3)tem检测
[0065]
使用jem2100电子显微镜在200kv的加速电压下观察纳米胶束(光解条件：uv 0.196w/cm2，320-480nm，15min)的形态。将适量的聚合物溶液(pbs中空白胶束浓度为1mg/ml，ph 7.4)滴到400目碳支撑的铜网格中，并用滤纸除去过量的溶液。试验在室温下在黑暗中挥发24小时后进行。
[0066]
结果如图4所示，p2b尺寸约为40nm的“核-壳”球形结构。载药纳米胶束(p2&dox)的大小约50nm，并且在颗粒的核心中散布有黑点，表明药物dox的成功装载。同时经紫外光照射后空白纳米胶束及载dox纳米胶束结构破坏，所搭载的dox实现控制释放。
[0067]
(4)稳定性检测
[0068]
将本发明制备得到的空白胶束p2b和负载dox的胶束p2&dox分散在37℃pbs缓冲液中，pbs缓冲液ph为7.4，通过动态光散射仪(dls)测定粒径变化及pdi。结果如图5所示，空白胶束p2b和载药胶束p2&dox的粒径变化基本稳定，在ph＝7.4的缓冲溶液中5天内保持在40nm左右，15天内pdi保持在0.4以下，这表明纳米胶束在生理环境中具有良好的稳定性。
[0069]
(5)载药纳米胶束照射后pcs计数率
[0070]
将本发明制备得到的空白胶束p2和负载dox的胶束p2&dox分散在pbs缓冲液(ph＝7.4)中，用uv光照射(0.196w/cm2，320-480nm，15min)，对照组不进行uv光照射，通过动态光散射仪(dls)检测照射后各组pcs计数率的变化，结果如图6所示。从图中可以看到，空白及载药胶束经uv光照射15分钟的时间内计数率变化明显降低，纳米结构降解约50％。而对照组计数率变化曲线相对平缓，表明所制备的光响应载药体系具有明显的稳定性及光分解特性。
[0071]
(6)载药纳米胶束药物释放率检测
[0072]
用荧光分光光度计(hitachi u-4100)测定了负载dox聚合物纳米胶束的药物释放率。精确称量冷冻干燥的dox负载的聚合物纳米胶束(5mg)，并将其分散在pbs缓冲液(5ml，ph＝7.4)中。稳定30分钟后，将其转移到透析袋(mwco＝3.5kda)中，然后将其置于95ml pbs缓冲液中，并在恒温摇床(37℃，100rpm)中体外释放。在特定时间点取透析袋的外部溶液(4ml)，并补充相同的新缓冲液(4ml)。通过荧光分光光度计测量释放溶液中dox的含量。结果如图7所示，在没有uv光照射的情况下，dox在48小时后的累积释放仅为19.80％，表明dox负载的np在正常生理条件下(如血液)具有相对良好的稳定性。nps的疏水核心保持dox分子积聚并锁定在nps内部。相比之下，在30分钟的紫外线照射下，dox的累积释放量是非紫外线
照射的两倍，48小时后达到46.3％，这与pcs计数率的结果基本一致。
[0073]
(7)载药纳米胶束的体外1h和
19
f mri成像
[0074]
在配有1h/
19
f双探头(rf res 1
h/
19
f 075/040lin/lin，外径75mm，内径40mm)的7.0t 200mm横向孔显微成像系统(bruker biospec 70/20usr)上进行mri测试。使用flash序列获得
19
f mri图像，设置参数为tr/te＝800/1.3ms，fa＝30.0，fov＝40*40mm，mtx＝32，平均值＝20。使用rare序列获得1h mri图像，设定参数为tr/te＝2000/33ms，fa＝180.0，fov:40*40m，mtx＝256，平均值＝20。将两种不同疏水链段长度的载药纳米胶束分散在pbs(ph＝7.4)的缓冲液中(
19
f nmr的溶剂为d2o)，浓度为10mg/ml，分别进行体外1h和
19
f mri成像，结果如图8a所示，从图中可以看到两种空白胶束的1h和
19
f mri成像均表现出良好的成像能力。图8b是
19
f nmr检测结果，从图中可以看出所有
19
f nmr光谱在-75.51ppm处显示出单一的谱线和尖锐的单峰，表明纳米胶束具备良好的成像灵敏度。
[0075]
(8)空白纳米胶束的细胞毒性检测
[0076]
通过mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)染色法检测空白胶束(p1b和p2b)对huvec细胞的毒性。首先，接种细胞，将对数生长期细胞设置为8个浓度和4个多孔。将细胞接种在96孔板(100μl/孔，3000/孔)中。他们在二氧化碳培养箱中培养。第二天，制备样品(1.56-100μm)，并设置0μm的对照组。从96孔板中取出旧培养基，以100μl/孔的速度添加样品。然后在二氧化碳培养箱中进行培养。24小时后，以10ul/孔加入mtt(5mg/ml)，然后在二氧化碳培养箱中孵育。4h后，从96孔板中取出上清液，并以100μl/孔的速度加入dmso。用锡箔包裹后，振荡10分钟，使晶体充分熔化。在酶联免疫吸附测定法上测量每个孔在490nm处的吸光度,结果如图9所示。培养48小时后，即使空白胶束(p1b和p2b)浓度达到100μm，huvec的细胞活力仍高于90％，表明所制备的载药胶束具有良好的生物相容性。
[0077]
(9)载药纳米胶束的细胞杀伤效果
[0078]
空白胶束p2b降解产物的mtt活性通过在uv照射(0.196w/cm2，320-480nm，30min)条件下来测试，随后进行与上述细胞毒性测试相同的程序。结果如图10所示，光降解后huvec细胞的存活率都保持在相同水平。当浓度达到100μm时，huve细胞的存活率仍高于90％。这表明降解产物同样不具备生物毒性。
[0079]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。