一种促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法与流程

本发明属于细胞培养领域，具体涉及到一种促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法。

背景技术：

1、牙囊是附着于牙齿外胚的间充质结缔组织，围绕在牙釉质和牙乳头周围，具有调节破骨细胞和成骨细胞的萌生的作用。研究发现，牙囊源间充质干细胞来源于神经嵴，能够形成牙周韧带、牙本质和牙槽骨。通过诱导实验证明牙囊源间充质干细胞能够分化形成成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、软骨细胞、神经元、肝细胞、唾液腺细胞和核导管细胞。其中，牙囊源间充质干细胞形成与骨和牙本质相关的细胞和组织的能力得到广泛研究和认可，目前牙囊源间充质干细胞正积极应用于牙周缺损再生修复、组织工程生物牙根重建以及牙槽骨修复研究，近年来在其他组织损伤和免疫系统疾病的治疗潜能也被不断挖掘。

2、已有研究利用牙囊源间充质干细胞复合生物支架构建出了生物牙根；另外，通过其自身的成骨分化潜能促进牙槽骨组织再生的效果也较理想；牙囊源间充质干细胞还能在炎性微环境的刺激下快速增殖，具有较低的免疫原性和组织相容性，并促进牙周缺损动物模型再生出新的牙周复合体，实现了牙周“三明治结构”的重建。由此看来，牙囊源间充质干细胞拥有良好的临床转化价值。不仅如此，牙囊源间充质干细胞还可通过释放细胞因子、趋化因子对炎症免疫反应起到调节作用。相比于其他牙齿来源干细胞，牙囊源间充质干细胞具有易于规模化扩增、来源丰富、免疫调节力强和多向分化潜能等特点，在异体细胞移植方面占有一定优势，因此在再生医学领域是潜在的临床治疗手段。但目前仍缺少一种高效、稳定且方便快捷的方法进行牙囊源间充质干细胞的制备。

3、目前牙囊源间充质干细胞提取的主要方法是酶消化法，传统的酶消化法操作过程较繁琐，在分离获取过程中，由于需要加入相应的消化酶进行消化，如分散酶、ⅰ型胶原酶和dna酶组成的混合酶消化液对牙源性乳糜状组织进行消化，需要充分长的消化时间及相关的设备满足消化过程的实现，而在消化时间过长时，会导致细胞损伤较大，影响细胞得率及后期培养；另外，胶原酶来自于细菌提取物，存在残留细菌成分的可能性，胶原酶中的内毒素可能非特异性激活干细胞或产生一些其他负面影响；不同批次胶原酶质量的差异也会对干细胞的产量造成影响，所以通过此种消化方式获得的干细胞引入的外源风险因素更高；并且消化酶的浓度与消化时间对干细胞的产量和活性都有一定程度的影响；现阶段制备的牙囊源间充质干细胞，并没有经过初步的筛选优化过程，对于临床应用需求方面稍显欠缺；有研究提示牙乳头细胞可通过细胞间的相互作用促进牙囊干细胞向成骨细胞方向分化和骨形成，但获得牙乳头细胞较为困难。

4、综上所述，发明一种操作简便，减少外源风险因子带入，提高牙囊源间充质干细胞的生物学特性的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法对细胞培养领域具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述不足，本发明提供一种操作简便，减少外源风险因子带入并且提高牙囊源间充质干细胞的生物学特性的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法。

2、一种促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

3、(1)制备自体牙囊源间充质干细胞和牙髓源间充质干细胞：

4、将牙囊和牙髓组织分别剪碎，清洗，离心，去除上清液；将处理过的牙囊和牙髓组织分别用无血清培养基重悬后，接种进行培养，至细胞融合度为45～55％，得到原代牙囊细胞和原代牙髓细胞，分别传代培养，获得牙囊源间充质干细胞和牙髓源间充质干细胞；

5、(2)制备牙髓源间充质干细胞外囊泡：

6、将步骤(1)所得牙髓源间充质干细胞接种培养，清洗后将细胞转入无血清诱导培养基中培养，经多次清洗后取沉淀，获得牙髓源间充质干细胞外囊泡；

7、(3)诱导牙囊源间充质干细胞：

8、复苏牙囊源间充质干细胞，传代培养后，在牙囊源间充质干细胞培养体系中加入牙髓源间充质干细胞外囊泡，进行诱导培养，待细胞融合度达到85％-95％收获细胞，制成牙囊源间充质干细胞悬液。

9、采用上述技术方案，本发明的有益效果为：

10、本发明采用自体牙髓源间充质干细胞外囊泡对牙囊源间充质干细胞进行诱导，且制备牙囊源间充质干细胞和牙髓源间充质干细胞的过程中，未采用消化酶进行细胞提取，减少外源风险引入，降低由于操作导致的细胞特性的损伤，定性诱导筛选出的牙囊源间充质干细胞有利于成骨分化，提高牙囊源间充质干细胞的临床应用效果。

11、进一步地，步骤(1)中牙囊和牙髓组织被剪碎后的体积为0.001～75mm3，优选为1mm3离心的速度为1000～1200r/min，优选为1000r/min，时间为5～8min，优选为5min。

12、采用上述进一步技术方案的有益效果为：

13、牙囊和牙髓组织破碎后的体积为0.001～75mm3，在此区间内易于细胞分离提取并且不易对细胞造成损伤。

14、进一步地，步骤(1)中牙囊和牙髓组织在温度为36～38℃，二氧化碳的体积分数为4～6％的环境下进行培养，每隔3～5天更换培养液，优选温度为37℃，二氧化碳的体积分数为4％的环境下进行培养，每隔4天更换培养液。

15、采用上述技术方案的有益效果为：

16、在此环境下有利于牙囊和牙髓组织培养，使细胞能够快速融合。

17、进一步地，步骤(1)中接种培养的密度为5000～10000个/cm2，优选为10000个/cm2。

18、采用上述进一步技术方案的有益效果为：

19、以此密度接种进行原代培养，有利于细胞增殖，密度过高，细胞内生物质的浓度增加，容易使排除物或其他代谢产物达到饱和，使能量来源很快耗尽，妨碍细胞增殖，密度过小，容易导致细胞生长过快，造成过早老化。

20、进一步地，步骤(2)中牙髓源间充质干细胞外囊泡在温度为-85～-80℃的环境下保存，优选为-80℃。

21、采用上述进一步技术方案的有益效果为：

22、将制备出的牙髓源间充质干细胞外囊泡在温度为-85～-80℃的环境下保存，有利于保持牙髓源间充质干细胞外囊泡的活性。

23、进一步地，步骤(4)牙囊源间充质干细胞传代培养至3～5代。

24、采用上述进一步技术方案的有益效果为：

25、将牙囊源间充质干细胞培养至3～5代，使得牙囊源间充质干细胞更为稳定。

26、综上所述，本发明的有益效果为：

27、本发明通过贴壁法培养牙囊源间充质干细胞，一方面减少了外源风险因子的带入，提高了临床应用的安全性，另一方面，最大程度的降低了由消化过程导致的细胞损伤，从而保证了牙囊源间充质干细胞的基本生物学特性；另外，在无外援物质加入的情况下，通过自体牙髓源间充质干细胞外囊泡的诱导作用，定向诱导牙囊源间充质干细胞，使获得的牙囊源间充质干细胞具有更好的成骨分化能力，提高临床应用效果的同时避免了外源物质引起的生物相容性差的问题。

技术特征：

1.一种促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)牙囊和牙髓组织被剪碎后的体积为0.001～75mm3，离心速度为1000～1200r/min，时间为5～8min。

3.根据权利要求2所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)牙囊和牙髓组织被剪碎后的体积为1mm3，离心的速度为1000r/min，时间为5min。

4.根据权利要求1所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)牙囊和牙髓组织在温度为36～38℃，二氧化碳的体积分数为4～6％的环境下进行培养，每隔3～5天更换一次培养液。

5.根据权利要求1所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)牙囊和牙髓组织在温度为37℃，二氧化碳的体积分数为5％的环境下进行培养，每隔4天更换一次培养液。

6.根据权利要求1所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中接种培养的密度为5000～10000个/cm2。

7.根据权利要求6所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中接种培养的密度为10000个/cm2。

8.根据权利要求1所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)获得牙髓源间充质干细胞外囊泡后在温度为-85～-80℃的环境下保存。

9.根据权利要求1或8所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)获得牙髓源间充质干细胞外囊泡后在温度-80℃的环境下保存。

10.根据权利要求1所述的促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)牙囊源间充质干细胞传代培养至3～5代。

技术总结
本发明提供了一种促进成骨分化的牙囊源间充质干细胞的培养方法，该培养方法包括以下步骤：(1)制备自体牙囊源间充质干细胞和牙髓源间充质干细胞；(2)制备牙髓源间充质干细胞外囊泡；(3)诱导牙囊源间充质干细胞。采用本发明方法培养牙囊源间充质干细胞，操作简便，可以减少外源风险因子的带入，提高牙囊源间充质干细胞的临床安全性；降低由于操作导致的细胞特性的损伤，提高牙囊源间充质干细胞的生物学特性；采用本发明方法筛选出的牙囊源间充质干细胞有利于成骨分化，提高牙囊源间充质干细胞的临床应用效果。

技术研发人员：高雪华,江蕊利,侯爽,梁琳华,樊慧
受保护的技术使用者：成都清科生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12