PCR试剂盒、反应体系及方法与流程

本发明涉及分子生物学，特别是涉及一种pcr试剂盒、反应体系及方法。

背景技术：

1、真菌(学名：fungi)，是一种具真核的、产孢的、无叶绿体的真核生物。包含霉菌、酵母、蕈菌以及其他人类所熟知的菌菇类，目前已经发现了十二万多种真菌。与人类的健康密切相关，同时某些真菌还能被安全地利用于食品生产和生物化工领域。

2、真菌分子生物学研究是微生物研究的一个重要领域，但由于真菌的细胞壁结构特殊，抗逆性强，使得真菌的核酸提取尤其困难，使用传统的真菌基因组提取方法较为繁琐。传统的真菌dna提取方式耗时费力，而市面上通过裂解液裂解后直接pcr的直扩法虽然操作简单，但成功率较低。现在市面上相关产品的裂解液还存在以下问题：裂解的上清中或多或少的都会存在pcr的抑制物，导致pcr反应的成功率不高和pcr产量较低。目前已有一些报道提供了裂解液和pcr预混液的配方，都可用于pcr直扩反应，成功率较高。如cn115181740a记载的一种裂解液和cn115109844a记载的一种pcr预混液。但是这些专利申请都是基于水稻叶片分子水平上的研究，通过提取水稻叶片的dna和扩增出相应的基因片段，不适用于真菌dna提取和pcr直扩领域。

3、目前还未有高准确率、高成功率的pcr反应提取液和pcr预混液，适用于真菌pcr直扩领域。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种pcr试剂盒、反应体系及方法，使裂解液与预混液相互适配，保证pcr直扩反应的成功率和提高pcr产量。

2、本申请的第一个方面，提供了一种pcr试剂盒，包含裂解液；和/或，pcr预混液；

3、所述裂解液包含水以及10mm～100mm tris-hcl、0.5mm～1mm na2edta和0.05％～0.25％(w/v)sds；

4、所述pcr预混液包含水以及亲和体、taq dna聚合酶、mg2+、dntp、tris-hcl、nh4+、k+、表面活性剂、甜味剂、dntp、甜菜碱、牛血清白蛋白、海藻糖和甘油。

5、在其中一些实施例中，所述pcr预混液中亲和体和taq dna聚合酶的浓度比为1：(0.6～10)。

6、在其中一些实施例中，所述pcr预混液包含水以及100ng/μl～500ng/μl亲和体、taq dna聚合酶、mg2+、dntp、tris-hcl、nh4+、k+、表面活性剂、甜味剂、dntp、甜菜碱、牛血清白蛋白、0.01m～0.1m海藻糖和0.5％～2％甘油。

7、在其中一些实施例中，所述pcr预混液包含40mm～60mm tris-hcl、1mm～4mm mg2+、10mm～30mm nh4+、20mm～60mm k+、0.2％(v/v)～0.5％(v/v)表面活性剂、0.01％(m/v)～0.1％(m/v)bsa、0.3m～0.8m甜菜碱、0.01m～0.1m海藻糖、0.5％～2％甘油、50ng/μl～150ng/μl taq mut4 dna聚合酶、100ng/μl～500ng/μl亲合体和10μm～200μm dntp。

8、在其中一些实施例中，所述的试剂盒包含所述裂解液和所述pcr预混液。

9、本申请的第二个方面，提供了一种pcr反应体系，包含水以及所述的pcr预混液、上游引物、下游引物和模板dna。

10、在其中一些实施例中，每25μl所述反应体系包含水以及所述的pcr预混液、9.5μm～10.5μm上游引物0.9μl～1μl、9.5μm～10.5μm下游引物0.9μl～1μl和0.9μl～1μl模板dna。

11、在其中一些实施例中，每25μl所述反应体系包含水以及2×pcr预混液12.4μl～12.5μl、10μm上游引物0.9μl～1μl、10μm下游引物0.9μl～1μl、模板dna 0.9μl～1μl。

12、在其中一些实施例中，所述模板dna通过所述的裂解液制备。

13、本申请的第三个方面，提供了一种pcr方法，使用所述的试剂盒对真菌进行处理后，进行pcr反应。

14、与传统方案相比，本申请具有以下有益效果：

15、本申请提供了一种免dna提取的真菌pcr直扩的试剂盒，本申请的试剂盒中的裂解液，无需进行核酸提取，可以用样本粗裂解液直接进行扩增，通过调整pcr预混液的配方成分，加入亲和体，海藻糖、甘油，taq dna聚合酶，融合了亲合体热启动技术，最大程度的匹配了所述裂解液，减弱了所述裂解液中pcr抑制物的抑制效果，通过改造核心酶的性能，提升了预混液的耐脏性，使裂解液与预混液相互适配，保证pcr直扩反应的成功率和提高pcr产量。

技术特征：

1.一种pcr试剂盒，其特征在于，包含裂解液，和/或，pcr预混液；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr预混液中亲和体和taq dna聚合酶的浓度比为1：(0.6～10)。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr预混液包含水以及100ng/μl～500ng/μl亲和体、taq dna聚合酶、mg2+、dntp、tris-hcl、nh4+、k+、表面活性剂、甜味剂、dntp、甜菜碱、牛血清白蛋白、0.01m～0.1m海藻糖和0.5％～2％甘油。

4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr预混液包含40mm～60mm tris-hcl、1mm～4mm mg2+、10mm～30mm nh4+、20mm～60mm k+、0.2％(v/v)～0.5％(v/v)表面活性剂、0.01％(m/v)～0.1％(m/v)bsa、0.3m～0.8m甜菜碱、0.01m～0.1m海藻糖、0.5％～2％甘油、50ng/μl～150ng/μl taq mut4 dna聚合酶、100ng/μl～500ng/μl亲合体和10μm～200μm dntp。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含所述裂解液和所述pcr预混液。

6.一种pcr反应体系，其特征在于，包含水以及如权利要求1～5任一项所述的pcr预混液、上游引物、下游引物和模板dna。

7.根据权利要求6所述的pcr反应体系，其特征在于，每25μl所述反应体系包含水以及所述的pcr预混液、9.5μm～10.5μm上游引物0.9μl～1μl、9.5μm～10.5μm下游引物0.9μl～1μl和0.9μl～1μl模板dna。

8.根据权利要求7所述的pcr反应体系，其特征在于，每25μl所述反应体系包含水以及2×pcr预混液12.4μl～12.5μl、10μm上游引物0.9μl～1μl、10μm下游引物0.9μl～1μl、模板dna 0.9μl～1μl。

9.根据权利要求7或8所述的pcr反应体系，其特征在于，所述模板dna通过权利要求1所述的裂解液制备。

10.一种pcr方法，其特征在于，使用权利要求1～5任一项所述的试剂盒对真菌进行处理后，进行pcr反应。

技术总结
本发明提供了一种PCR试剂盒，包含裂解液和PCR预混液；所述裂解液包含10mM～100mM Tris‑HCl、0.5mM～1mM Na<subgt;2</subgt;EDTA、0.05％～0.25％(w/v)SDS；所述PCR预混液包含水以及亲和体、Taq DNA聚合酶、Mg<supgt;2+</supgt;、dNTP、Tris‑HCl、NH<subgt;4</subgt;<supgt;+</supgt;、K<supgt;+</supgt;、表面活性剂、甜味剂、dNTP、甜菜碱、牛血清白蛋白、海藻糖和甘油。本发明的PCR试剂盒，通过调整PCR预混液的配方成分，最大程度的匹配了所述裂解液，提升了预混液的耐脏性，使裂解液与预混液相互适配，保证PCR反应的成功率和提高PCR产量。

技术研发人员：杜军,汪江涵,曹文刚,宋辉,樊浩,许净
受保护的技术使用者：湖北擎科生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13