一种用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物及其应用

本发明属于分子生物学，具体涉及一种用于检测长棘海星环境dna的引物组合物及其应用。

背景技术：

1、珊瑚礁生态系统是海洋中生物多样性最丰富、初级生产力最高的生态系统之一。作为造礁石珊瑚最主要的敌害生物之一，长棘海星(acanthaster planci)的灾害暴发是印度洋-西太平洋海域珊瑚覆盖率持续下降和珊瑚礁退化的主要原因之一。2019年至今，南沙群岛七岛礁海域均发生不同程度的长棘海星暴发灾害，部分海域珊瑚死亡率超过90％。东沙和中沙也分别在2019年和2020年监测到严重的长棘海星灾害。长此以往，将严重威胁到南海珊瑚礁生态系统健康，乃至整个南海海洋生物多样性和岛礁安全。

2、目前国际上有关长棘海星暴发的防控手段主要有药物注射、人工打捞移除、水下栅栏阻隔和生物防治等方法。然而，这些都是后置性应急处置措施。及早发现或预测到长棘海星的种群暴发，进行重点控制和集中管理，是开展长棘海星灾害处置的当务之急。随着分子生物学研究手段的不断发展，以环境dna技术为代表的分子生态学检测手段为实现长棘海星种群动态的有效监测提供了可能。现阶段，对长棘海星环境dna的检测方法主要是常规绝对定量pcr和荧光实时定量pcr。但是，常规绝对定量pcr需要特殊的热循环设备、其产物仍需电泳检测；荧光实时定量pcr具有较高的灵敏性，但反应过程时间长、需要具备荧光探测和分析的仪器。因此，现有的长棘海星环境dna检测方法受制于上述缺陷，无法满足野外现场监测的需求。研发适用于长棘海星环境dna检测的现场诊断技术对于有效防控长棘海星大规模种群暴发意义重大。

3、基于重组酶-聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)由英国公司twistdx inc开发。该技术依赖重组酶介导引物与目标片段序列结合，使核酸扩增反应脱离了传统pcr反应必须经历的变性、退火和延伸的热循环步骤，进一步触发聚合酶对目标片段进行指数扩增。最佳反应温度在反应速度快，10～20分钟即可获得可检出水平的扩增产物。针对rpa扩增产物的检测，实时荧光rpa可对扩增反应进程实时监控，但需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如可控温酶标仪或荧光pcr仪；相比而言，试纸条rpa对硬件条件要求更低，只需完成控温扩增反应，随后通过侧向流层析试纸条读取试验结果。因此，试纸条rpa更适合于现场检测的应用，本发明据此开发了基于试纸条rpa的长棘海星环境dna检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有环境dna检测技术需要特殊的设备，反应过程时间长，无法满足野外现场监测需求的问题。

2、为此，本发明提供了一种用于检测长棘海星环境dna的引物组合物，包括上游引物和下游引物；

3、所述上游引物的序列为5’-cttgaacaatgtacgctaccgacaattc g-3’

4、所述下游引物的序列为5’-catcaatgctttatggcctctgcgtgaa gtc-3’。

5、具体的，上述引物组合物还包括探针；所述探针的序列为5’-fam-agctgtagccctgccttgtagcgaatgcgttcttg-thf-atgc tgaagccttg-spc3-3’；其中，fam表示羧基荧光素标记，thf表示四氢呋喃连接子形成缺刻，spc3表示spacer c3修饰。

6、本发明提供的上述引物组合物可用于长棘海星种群动态检测和灾害防控预警。

7、本发明还提供了包括上述用于检测长棘海星环境dna的引物组合物的试剂盒。

8、进一步的，本发明还提供了一种检测长棘海星环境dna的方法，包括以下步骤：

9、(1)在目标海域采集海水样品并提取总环境dna；

10、(2)采用上述引物组合物进行rpa扩增反应；

11、(3)分析rpa扩增结果，判断海水样品中是否含有长棘海星。

12、具体的，上述步骤(2)中rpa扩增反应的反应体系以50μl计，包括：水化缓冲液29.5μl，280mm醋酸镁2.5μl，10μm的上游引物和下游引物各2.1μl，探针引物0.6μl，长棘海星环境dna模板5μl，depc水8.2μl。

13、具体的，上述步骤(2)中rpa扩增反应的反应条件为37℃恒温孵育20分钟。

14、具体的，上述步骤(3)为：利用胶体金侧向流免疫层析试纸条分析rpa扩增产物，读取试纸条结果，判断是否含有长棘海星dna扩增产物，进而判断海水样品中是否含有长棘海星。

15、具体的，上述步骤(3)为：将5μl rpa扩增产物加入95μl稀释液进行稀释，然后将稀释后rpa扩增产物滴加至胶体金侧向流免疫层析试纸条加样端，读取试纸条结果。

16、具体的，上述稀释液包括25mm tris、150mm nacl和0.05％ tween20。

17、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

18、(1)本发明提供的这种用于检测长棘海星环境dna的引物组合物是根据已测序长棘海星基因组序列(ncbi gca_001949145.1)，对特异性非编码区域进行筛选，并针对零突变保守区域设计的成套引物。特异性强，灵敏度高，检测靶位点保守性高、不存在突变碱基，检测结果准确，能够减少检测过程对仪器设备的依赖性，更好地应用于现场快速检测。

19、(2)本发明提供的检测长棘海星环境dna的方法将rpa恒温扩增技术与胶体金免疫层析试纸条联用，能够实现长棘海星环境dna的现场快速检测，最低能检测指示10个拷贝左右的长棘海星环境dna，并且具有较广的检测范围，至少在10-105范围内的样品均能被检测出来，具有很好的灵敏度。本发明的检测方法特异性试验结果良好，重复性试验具有很好的稳定性，为在野外条件下检测环境中的长棘海星dna提供了一种快速、便捷、经济的新方法，有助于开展长棘海星种群动态检测和灾害防控预警，具有重要的生态、经济和社会效益，应用前景广阔。

20、以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

技术特征：

1.一种用于检测长棘海星环境dna的引物组合物，其特征在于：包括上游引物和下游引物；

2.如权利要求1所述的用于检测长棘海星环境dna的引物组合物，其特征在于：还包括探针；所述探针的序列为5’-fam-agctgtagccctg ccttgtagcgaatgcgttcttg-thf-atgctgaagccttg-spc3-3’；其中，fam表示羧基荧光素标记，thf表示四氢呋喃连接子形成缺刻，spc3表示spacer c3修饰。

3.如权利要求1-2任意一项所述的用于检测长棘海星环境dna的引物组合物在长棘海星种群动态检测和灾害防控预警中的应用。

4.一种用于检测长棘海星环境dna的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-2任意一项所述的引物组合物。

5.一种检测长棘海星环境dna的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的检测长棘海星环境dna的方法，其特征在于，所述步骤(2)中rpa扩增反应的反应体系以50μl计，包括：水化缓冲液29.5μl，280mm醋酸镁2.5μl，10μm上游引物和下游引物各2.1μl，探针引物0.6μl，长棘海星环境dna模板5μl，depc水8.2μl。

7.如权利要求6所述的检测长棘海星环境dna的方法，其特征在于：所述步骤(2)中rpa扩增反应的反应条件为37℃恒温孵育20分钟。

8.如权利要求5所述的检测长棘海星环境dna的方法，其特征在于，所述步骤(3)为：利用胶体金侧向流免疫层析试纸条分析rpa扩增产物，读取试纸条结果，判断是否含有长棘海星dna扩增产物，进而判断海水样品中是否含有长棘海星。

9.如权利要求8所述的检测长棘海星环境dna的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：将5μl rpa扩增产物加入95μl稀释液进行稀释，然后将稀释后rpa扩增产物滴加至胶体金侧向流免疫层析试纸条加样端，读取试纸条结果。

10.如权利要求9所述的检测长棘海星环境dna的方法，其特征在于：所述稀释液包括25mm tris、150mm nacl和0.05％tween20。

技术总结
本发明属于分子生物学技术领域，具体提供了一种用于检测长棘海星环境DNA的引物组合物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为5’‑CTTGAACAATGTACGCTACCGACAATTCG‑3’；所述下游引物的序列为5’‑CATCAATGCTTTATGGCCTCTGCGTGAAGTC‑3’。还包括探针5’‑FAM‑AGCTGTAGCCCTGCCTTGTAGCGAATGCGTTCTTG‑THF‑ATGC TGAAGCCTTG‑SpC3‑3’。本发明还提供了利用上述引物组合物检测长棘海星环境DNA的方法。突破了传统PCR检测手段的局限，实现了常温条件下长棘海星环境DNA的快速检测，在长棘海星种群动态监测和暴发成灾预警中拥有广阔的应用前景。

技术研发人员：周智,朱云杰,刘兆群,吴钟解,唐佳,邢家杰
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12