一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂及其应用

本发明属于生物制剂，特别涉及一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂及其应用。

背景技术：

1、氢能源作为未来的主要环保型能源，已经引起人们的高度重视。作为氢能源的制备方法之一，生物制氢技术由于其具有制氢原料易得、与废水、废弃物处理项目相结合等优点受到广泛地关注。

2、然而，生物制氢通常在大规模工艺水平上受限制，这影响了其商业应用。因此，研究者们研究了各种加强工艺，例如：改进反应条件以提高有机底物的利用度、优化工艺参数以提高制氢速率、应用合成生物学和基因工程方法提高氢气产量。然而上述方法是费力耗时的，并且增加了制氢成本。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂及其应用，以达到提高氢气产量，降低成本的目的。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂，所述纳米硒生物制剂是由大肠杆菌mg1655和亚硒酸钠通过生物法制得的纳米硒senps，或者由纳米硒senps经过壳聚糖改性的改性纳米硒ch-senps，或者由纳米硒senps经过维生素e改性的改性纳米硒ve-senps。

4、上述方案中，生物法制备纳米硒senps的方法如下：

5、(1)在锥形瓶中加入灭菌后的lb培养基，然后将300～500mmol l-1亚硒酸钠过0.22um膜添加到锥形瓶中，在无菌操作台中接种1％的大肠杆菌mg1655，然后将锥形瓶放置在温度为30±2℃，转速为150-300转/分钟的摇床培养箱中好氧培养0.5～7d，以8000～10000rpm离心培养物10～20分钟，重复3次，所得沉淀为大肠杆菌mg1655与其产物生物硒的混合物；

6、(2)用0.1m pbs溶液洗涤沉淀并重悬；然后在研钵中加入悬浮液并用液氮速冻，反复杵打使其破碎，重复该步骤3次；然后再以100-300w条件下超声处理10～20分钟经液氮研磨后的悬浮液，使得菌体破碎释放出纳米硒，且纳米硒粒径达到200nm以下，继续以转速8000～10000rpm离心破碎后的混合物5～10min；用0.1m含1％sds的tis-hcl缓冲液洗涤沉淀并在10000rmp转速下离心5～10min，重复3次；将沉淀物悬浮于去离子水中，即得到含有纳米硒和细胞碎片的混合悬浮液；

7、(3)上述悬浮液转移到分液漏斗中，并加入正辛醇，悬浮液与正辛醇的体积比为1：2～2：1，在4℃下静置过夜，随后出现分层：上层为正辛醇，中间为菌体细胞碎片，下层为硒纳米颗粒悬浊液；分离出下层的硒纳米颗粒悬浊液，5000rmp转速下离心10min；依次用氯仿、乙醇、去离子水分别洗涤3次至完全去除菌细胞碎片，得到纯净的纳米硒senps；

8、(4)用去离子水重悬纯净的纳米硒senps，得到纳米硒senps溶液，储存在4℃备用。

9、上述方案中，壳聚糖改性的方法如下：配制质量浓度为0.1％～1％的壳聚糖溶液，逐滴滴加到纳米硒senps溶液中，磁力搅拌30min，得到改性纳米硒ch-senps。

10、上述方案中，维生素e改性的方法如下：配制体积浓度为0.2％～1％的维生素e溶液，逐滴滴加到纳米硒senps溶液中，磁力搅拌30min，得到改性纳米硒ve-senps。

11、一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂的应用，将光合细菌接种到pm培养基中，添加碳源，在其生长阶段或非生长阶段，添加纳米硒生物制剂，在提供光照的培养箱中厌氧培养，制得氢气。

12、上述方案中，所述光合细菌为产氢菌株rhodopseudomonas palustris cga009。

13、上述方案中，所述pm培养基经过高温灭菌，且不含硫酸铵，以乙酸作为碳源，向pm培养基中曝高纯n2使得产氢菌株处于生长阶段，添加纳米硒生物制剂，在温度为30℃、光强为3000lux的培养箱中厌氧培养。

14、上述方案中，在光合细菌生长情况下，纳米硒senps的应用浓度小于等于0.1mg/l，改性纳米硒ch-senps的应用浓度小于等于0.5mg/l，改性纳米硒ve-senps的应用浓度小于等于0.25mg/l。

15、上述方案中，所述pm培养基经过高温灭菌，且不含硫酸铵，以乙酸作为碳源，向pm培养基中曝高纯n2使得产氢菌株进行生长，当生长到对数中期时，厌氧离心培养物并用空白培养基洗涤三次，将离心后的菌体接种到用ar取代n2的不含硫酸铵pm培养基中，使得菌体处于氮饥饿状态，此时菌体处于非生长阶段，然后添加纳米硒生物制剂，在提供光照的培养箱中厌氧培养，制得氢气。

16、上述方案中，在光合细菌非生长情况下，改性纳米硒ve-senps的应用浓度为0.1mg/l。

17、通过上述技术方案，本发明提供的一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂及其应用具有如下有益效果：

18、1、本发明制得的纳米硒生物制剂，因其纳米尺寸与球形外貌，可容易地进入到菌体内发挥作用，再者，由于硒的价态丰富，因此本身带有电子，可参与到生化反应中去。

19、2、本发明将毒性大的亚硒酸盐通过大肠杆菌生物法制备得到纳米零价硒，显著降低了硒的毒性，壳聚糖与维生素e包裹的纳米硒进入到菌体内不会产生氧化应激，其毒性更是大大降低。

20、3、本发明的纳米硒生物制剂进入到光合细菌的细胞内，不论菌体处于生长还是非生长状态，纳米硒生物制剂都可与胞内固氮酶结合，介导固氮酶利用氮气产生h2的过程，使得产氢效果显著提高，且成本低，应用前景非常广阔。

21、4、本发明将功能性纳米材料与生物系统相结合，不论对于材料的改进还是生物工程都有巨大实际意义，达到了1+1＞2的效果。

技术特征：

1.一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂，其特征在于，所述纳米硒生物制剂是由大肠杆菌mg1655和亚硒酸钠通过生物法制得的纳米硒senps，或者由纳米硒senps经过壳聚糖改性的改性纳米硒ch-senps，或者由纳米硒senps经过维生素e改性的改性纳米硒ve-senps。

2.根据权利要求1所述的一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂，其特征在于，生物法制备纳米硒senps的方法如下：

3.根据权利要求1所述的一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂，其特征在于，壳聚糖改性的方法如下：配制质量浓度为0.1％～1％的壳聚糖溶液，逐滴滴加到纳米硒senps溶液中，磁力搅拌30min，得到改性纳米硒ch-senps。

4.根据权利要求1所述的一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂，其特征在于，维生素e改性的方法如下：配制体积浓度为0.2％～1％的维生素e溶液，逐滴滴加到纳米硒senps溶液中，磁力搅拌30min，得到改性纳米硒ve-senps。

5.一种如权利要求1所述的用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂的应用，其特征在于，将光合细菌接种到pm培养基中，添加碳源，在其生长阶段或非生长阶段，添加纳米硒生物制剂，在提供光照的培养箱中厌氧培养，制得氢气。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述光合细菌为产氢菌株rhodopseudomonas palustris cga009。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述pm培养基经过高温灭菌，且不含硫酸铵，以乙酸作为碳源，向pm培养基中曝高纯n2使得产氢菌株处于生长阶段，添加纳米硒生物制剂，在温度为30℃、光强为3000lux的培养箱中厌氧培养。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在光合细菌生长情况下，纳米硒senps的应用浓度小于等于0.1mg/l，改性纳米硒ch-senps的应用浓度小于等于0.5mg/l，改性纳米硒ve-senps的应用浓度小于等于0.25mg/l。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述pm培养基经过高温灭菌，且不含硫酸铵，以乙酸作为碳源，向pm培养基中曝高纯n2使得产氢菌株进行生长，当生长到对数中期时，厌氧离心培养物并用空白培养基洗涤三次，将离心后的菌体接种到用ar取代n2的不含硫酸铵pm培养基中，使得菌体处于氮饥饿状态，此时菌体处于非生长阶段，然后添加纳米硒生物制剂，在提供光照的培养箱中厌氧培养，制得氢气。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在光合细菌非生长情况下，改性纳米硒ve-senps的应用浓度为0.1mg/l。

技术总结
本发明公开了一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂及其应用，所述纳米硒生物制剂是由大肠杆菌MG1655和亚硒酸钠通过生物法制得的纳米硒SeNPs，或者由纳米硒SeNPs经过壳聚糖或维生素E改性的改性纳米硒Ch‑SeNPs或改性纳米硒Ve‑SeNPs。在光合细菌生长情况下，SeNPs的应用浓度小于等于0.1mg/L，Ch‑SeNPs的应用浓度小于等于0.5mg/L，Ve‑SeNPs的应用浓度小于等于0.25mg/L。在光合细菌非生长情况下，Ve‑SeNPs的应用浓度为0.1mg/L。本发明所公开的纳米硒生物制剂在生物制氢方面具有高效的促进作用，而且不会对环境造成二次污染。

技术研发人员：闫震,李思瑗,罗雅馨,石志睿,陈佳哲
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12