耐阿美替尼人肺腺癌细胞株PC9-AR及其应用的制作方法

本发明属于生物医药。具体涉及一种耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar及其应用。

背景技术：

1、肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，同时也是癌症相关死亡的首要原因。肺癌根据其病理类型分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,nsclc)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,sclc)。分子病理检测技术的发展及靶向治疗的应用显著提高了肺癌病人的生存期及生活质量。其中，egfr-tkis治疗在具有egfr激活突变的nsclc患者中疗效显著，但不可避免的耐药性的产生限制了其应用。

2、t790m突变为一代和二代egfr-tki治疗耐药的主要耐药机制，约有60％的患者出现此突变。egfr受体第790位苏氨酸残基位于atp结合裂隙后部疏水袋入口处，对于酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,tkis)的特异性结合至关重要，而t790m突变导致苏氨酸被甲硫氨酸取代，造成空间位阻效应干扰影响tkis的结合。同时，t790m突变导致突变体对atp的亲和力增加。而三代egfr-tkis则是针对egfr敏感突变和t790m突变研发的选择性、不可逆性酪氨酸激酶抑制剂。阿美替尼是一种新型、不可逆、高选择性的对于egfr敏感突变和t790m突变具有抑制作用的第三代egfr-tki。同时，阿美替尼已经在国内批准应用于具有egfr 19外显子缺失或21外显子l858r突变的局部晚期或转移性nsclc成人患者的一线治疗。但阿美替尼用于一线治疗的耐药机制尚不完全清楚，而且，目前国内外尚未有关于阿美替尼耐药机制的相关报道。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar及其应用。

2、为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明第一方面提供了一种耐阿美替尼的人肺腺癌细胞株pc9-ar，命名为耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar；所述耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期为2022年9月7日，保藏编号为cctcc no:c2022220，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

4、耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar是采用体外浓度梯度递增法，即通过逐步增加阿美替尼药物浓度，持续作用于具有egfr 19外显子缺失的pc9细胞株，诱导建立人肺腺癌阿美替尼耐药细胞株。其具体构建方法为：

5、(1)将人源具有egfr 19外显子缺失的肺腺癌细胞株pc9(本实验室库存)置于含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中，于37℃、5％ co2、饱和湿度的培养箱中培养，并使用胰蛋白酶消化液(0.25％trypsin-edta)消化传代；

6、(2)以1×106/ml细胞浓度将pc9接种于60mm培养皿中，24小时贴壁后，加入含有5nmol/l阿美替尼的完全培养基，置于37℃、5％ co2、饱和湿度的培养箱中培养；每2-3天更换一次含阿美替尼培养基(培养基中阿美替尼浓度不变)，待细胞耐受阿美替尼浓度并可稳定生长后，将培养基中阿美替尼浓度在此基础上倍增，并不断重复上述步骤，至pc9-ar在含有1umol/l阿美替尼的培养基中仍可以稳定生长、传代为止，即可得到本发明的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar。

7、本发明构建得到的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar可在作用浓度为1umol/l阿美替尼的培养体系中稳定生长、传代，对阿美替尼的耐药指数(ri)为1094.2，为研究阿美替尼耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、非小细胞肺癌对阿美替尼的耐药机制、非小细胞肺癌耐药相关信号通路的研究分析、抗肿瘤药物敏感性分析、制备抗肿瘤药物、筛选肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供了耐药细胞模型，具有较高的科研和生产应用价值。

8、本发明第二方面提供了耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar在筛选逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。

9、本发明第三方面提供了耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar在制备抗肿瘤药物中的应用。

10、本发明第四方面提供了耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar在在构建体外肿瘤耐药细胞模型中的应用。

11、根据上述的应用，优选地，所述肿瘤为肺癌。更加优选地，所述肺癌为非小细胞癌。最优选地，所述肺癌为肺腺癌。

12、与现有技术相比，本发明取得的有益技术效果如下：

13、本发明构建得到的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar可在作用浓度为1umol/l阿美替尼的培养体系中稳定生长、传代，对阿美替尼的耐药指数(ri)为1094.2，而且，该pc9-ar细胞株存在19外显子缺失突变，kras扩增，无c797s突变；因此，本发明构建的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar为研究阿美替尼耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、非小细胞肺癌对阿美替尼的耐药机制、非小细胞肺癌耐药相关信号通路的研究分析、抗肿瘤药物敏感性分析、制备抗肿瘤药物、筛选肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供了耐药细胞模型，具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。

技术特征：

1. 一种耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar，其特征在于，所述耐阿美替尼人肺腺癌细胞株pc9-ar的保藏编号为cctcc no:c2022220。

2.权利要求1所述阿美替尼耐药细胞株在筛选逆转肿瘤耐药性的药物中的应用。

3.权利要求1所述阿美替尼耐药细胞株在筛选、制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1所述阿美替尼耐药细胞株在构建体外肿瘤耐药细胞模型中的应用。

5.根据权利要求2-4任一所述应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞癌。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述肺癌为肺腺癌。

技术总结
本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种耐阿美替尼人肺腺癌细胞株PC9‑AR，其保藏编号为CCTCC NO:C2022220。该耐药细胞株PC9‑AR可在作用浓度为1umol/L阿美替尼的培养体系中稳定生长、传代，对阿美替尼的耐药指数（RI）为1094.2，而且，该PC9‑AR细胞株存在19外显子缺失突变，KRAS扩增，无C797S突变；因此，本发明构建的耐阿美替尼人肺腺癌细胞株PC9‑AR为研究阿美替尼耐药人非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、非小细胞肺癌对阿美替尼的耐药机制、非小细胞肺癌耐药相关信号通路的研究分析、抗肿瘤药物敏感性分析、制备抗肿瘤药物、筛选肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供了耐药细胞模型，具有较高的科研和生产应用价值。

技术研发人员：王启鸣,周涵琼,陈海洋,杨森,侯佳宝,浩利丹,张哲,朱逸晨,吴育锋,何振,刘杨,韦丹
受保护的技术使用者：河南省肿瘤医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13