用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合、试剂盒、方法与应用与流程

本公开涉及生物医学领域，尤其涉及用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合、试剂盒、方法与应用。

背景技术：

1、据统计，全球每年有超过95万新发胃癌病例，且年死亡病例超过72万；在中国，胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中排名第四。2015年，我国新增67.91万胃癌患者，死亡49.8万人。

2、我国胃癌的发病率和死亡率均排在所有癌症类型中的前几位，发病人数多，预后不佳。研究表明，胃癌的预后与诊治时机密切相关，早期胃癌5年生存率可达84％～99％；而进展期胃癌即使接受手术治疗，5年生存率仍低于30％；早期胃癌诊断标准是病灶浸润达黏膜层或者黏膜下层,无论是否有淋巴结转移，80％的早期胃癌往往没有明显症状，易被忽视。40岁以上、有胃癌家族史、幽门螺杆菌感染、慢性胃病、喜食腌制熏烤类食物、吸烟酗酒、压力大、生活不规律等是患胃癌的高危因素，建议相关人群进行预防性筛查。

3、目前，早期胃癌的诊断“金标准”仍为内镜下组织活检，而在我国大规模开展胃癌筛查条件尚不具备，同时也缺乏理想的生化或者生物学标志物检测作为筛查或普查胃癌的手段，虽然内镜下组织活检敏感度及特异度均较高，但由于其有创性、费用较高且部分地区医疗资源有限，故不能作为大规模人群的筛查手段。因此，亟需一种简单、易于实施的方法来判断是否需要进行大胃镜筛查。

技术实现思路

1、(一)发明目的

2、鉴于上述问题，为了能够通过简单、易于实施的手段来判断是否需要进行大胃镜筛查，本公开提供了以下技术方案。

3、(二)技术方案

4、本公开实施例的第一方面，提供了一种用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合，上述相关基因包括：rnf180基因、septin9基因、dact2基因、sdc2基因、nkd2基因和内参基因actb基因；

5、其中，检测上述rnf180基因的引物对序列如seq id no.1和seq id no.2所示，检测上述rnf18基因的探针序列如seq id no.3所示；

6、检测上述septin9基因的引物对序列如seq id no.4和seq id no.5所示，检测上述septin9基因的探针序列如seq id no.6所示；

7、检测上述dact2基因的引物对序列如seq id no.7和seq id no.8所示，检测上述dact2基因的探针序列如seq id no.9所示；

8、检测上述sdc2基因的引物对序列如seq id no.10和seq id no.11所示，检测上述sdc2基因的探针序列如seq id no.12所示；

9、检测上述nkd2基因的引物对序列如seq id no.13和seq id no.14所示，检测上述nkd2基因的探针序列如seq id no.15所示；

10、检测上述actb基因的引物对序列如seq id no.16和seq id no.17所示，检测上述actb基因的探针序列如seq id no.18所示。

11、本公开实施例的第二方面，提供了一种用于胃癌相关基因甲基化检测的试剂盒，包括上述用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合。

12、在一些可能的实施方式中，上述试剂盒还包括：pcr预混液和taq dna聚合酶扩增体系。

13、本公开实施例的第三方面，提供了一种胃癌相关基因甲基化检测方法，包括以下步骤：

14、s1、采集并分离静脉血得到血浆，提取上述血浆中的游离rnf180基因、septin9基因、dact2基因、sdc2基因和nkd2基因的基因片段，备用；

15、s2、将提取的游离rnf180基因、septin9基因、dact2基因、sdc2基因和nkd2基因的基因片段进行亚硫酸盐转化，设计包含上述引物探针组合的荧光pcr反应体系，利用上述荧光pcr反应体系对亚硫酸盐转化后的游rnf180基因、septin9基因、dact2基因、sdc2基因和nkd2基因的基因片段进行基因扩增；

16、s3、对步骤s2获取的基因扩增结果ct值与临界值进行比较分析，当ct值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的血浆中含有甲基化的rnf18基因、septin9基因、dact2基因、sdc2基因和nkd2基因中的至少一种。

17、在一些可能的实施方式中，上述采集并分离静脉血得到血浆，包括：

18、采集静脉血；

19、将上述静脉血进行两次离心后得到血浆。

20、在一些可能的实施方式中，步骤s2中进行基因扩增时rnf180基因选择fam荧光通道，septin9基因选择joe荧光通道，dact2基因选择fam荧光通道，sdc2基因选择joe荧光通道，nkd2基因选择texas red荧光通道，actb基因选择cy5荧光通道。

21、在一些可能的实施方式中，步骤s2中基因扩增的条件为95℃，300s，预变性；95℃，15s，变性；55℃，35s，运行45个循环进行退火、延伸及检测荧光。

22、在一些可能的实施方式中，步骤s3包括：

23、当内参基因actb基因的ct值≤30，rnf18基因的ct值≤35且有“s”扩增曲线，表明检测结果为阳性，rnf18基因发生了甲基化；

24、当septin9基因的ct值≤32且有“s”扩增曲线，表明检测结果为阳性，septin9基因发生了甲基化；

25、当dact2基因的ct值≤35且有“s”扩增曲线，表明检测结果为阳性，dact2基因发生了甲基化；

26、当sdc2基因的ct值≤32且有“s”扩增曲线，表明检测结果为阳性，sdc2基因发生了甲基化；

27、当nkd2基因的ct值≤35且有“s”扩增曲线，表明检测结果为阳性，nkd2基因发生了甲基化。

28、在一些可能的实施方式中，当内参基因actb基因的ct值＞30或无扩增，表示基因扩增结果无效。

29、本公开实施例的第四方面，提供了一种用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合在检测胃癌相关基因甲基化中的应用，上述相关基因包括：rnf180基因、septin9基因、dact2基因、sdc2基因、nkd2基因。

30、(三)有益效果

31、本公开实施例与现有技术相比存在的有益效果是：

32、在疑似病例中，先进行本公开的胃癌基因甲基化检测，阳性者，判断需胃镜进一步检查，阴性者，表明肠道症状非癌症引起，低风险，避免胃镜检查。可见，通过采用本公开的引物探针组合在进行检测时，能够避免不必要的大胃镜检查，整个过程可以简便的采用外周血体外检测，无创伤、简便易行。

技术特征：

1.一种用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合，其特征在于，所述相关基因包括：rnf180基因、septin9基因、dact2基因、sdc2基因、nkd2基因和内参基因actb基因；

2.一种用于胃癌相关基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合。

3.如权利要求2所述的用于胃癌相关基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：pcr预混液和taq dna聚合酶扩增体系。

4.一种胃癌相关基因甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述采集并分离静脉血得到血浆，包括：

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s2中进行基因扩增时rnf180基因选择fam荧光通道，septin9基因选择joe荧光通道，dact2基因选择fam荧光通道，sdc2基因选择joe荧光通道，nkd2基因选择texas red荧光通道，actb基因选择cy5荧光通道。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s2中基因扩增的条件为95℃，300s，预变性；95℃，15s，变性；55℃，35s，运行45个循环进行退火、延伸及检测荧光。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s3包括：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，当内参基因actb基因的ct值＞30或无扩增，表示基因扩增结果无效。

10.一种如权利要求1所述的用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合在检测胃癌相关基因甲基化中的应用，其特征在于，所述相关基因包括：rnf180基因、septin9基因、dact2基因、sdc2基因、nkd2基因。

技术总结
本公开提供了一种用于胃癌相关基因甲基化检测的引物探针组合、试剂盒、方法与应用，所述方法，包括：采集并分离静脉血得到血浆，提取所述血浆中的游离RNF180基因、SEPTIN9基因、DACT2基因、SDC2基因和NKD2基因的基因片段，备用；将上述基因片段进行亚硫酸盐转化，设计荧光PCR反应体系对基因片段进行基因扩增；对获取的基因扩增结果CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的血浆中含有甲基化的上述基因中的至少一种。通过采用本公开的引物探针组合在进行检测时，能够避免不必要的大胃镜检查，整个过程可以简便的采用外周血体外检测，无创伤、简便易行。

技术研发人员：赵娜,王校,吴电云,刘文波,胡长安,胡守旺,史文钊
受保护的技术使用者：神州医疗科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13