Cas3蛋白质的制造方法与流程

本发明涉及制造cas3蛋白质的方法，更具体地涉及在维持活性的状态下高纯度且高收率地制造重组cas3蛋白质的方法。

背景技术：

1、基因组编辑技术是通过在动物、植物的细胞中特异性地切割基因组dna序列，通过利用内在的修复机制，自由地重写成任意序列的技术。在世界中其应用不仅在生物科学研究中，还推广到农作物/畜产动物的品种改良、再生医疗、基因治疗等。

2、细菌、古细菌所具有的crispr-cas系统被分为通过多种蛋白质的复合体而切割靶标序列的1类、和通过单种蛋白质而切割的2类。到目前为止作为基因组编辑工具而开发出的crispr-cas9、crispr-cas12(cpf1)、crispr-cas13等全部被分类为2类，但最近发现了作为属于1类的i型crispr的crispr-cas3能够作为真核细胞的基因组编辑工具利用(专利文献1)。其中，判明了大肠杆菌k株来源的i型-e crispr-cas3除了3碱基的pam序列，还识别并结合27碱基作为靶标，在人培养细胞中能够在靶标序列的上游高效率地导入达数百～数kb的大范围的缺失突变。另外，与crispr-cas9相比，认为由于指导rna中的靶标识别序列长、不易产生非特异性的切割，因而安全性高。

3、crispr-cas3一般作为表达质粒导入细胞使其表达而被利用，但根据细胞的种类有时其导入和表达难、另外得不到充分的基因组编辑的效率。因此，期望将crispr-cas3以指导rna(crrna)和蛋白质(cas3蛋白质和级联反应蛋白质)的形态导入细胞。

4、然而，构成crispr-cas3的蛋白质群中，特别对于cas3蛋白质，到目前为止难以以充分的质和量制备能够经受实用的活性型。例如，作为已有的cas3蛋白质的纯化法，有关于嗜热菌褐色嗜热裂孢菌(thermobifida fusca)来源的cas3蛋白质(tfucas3)、大肠杆菌k株来源的cas3蛋白质(ecocss3)的报告(非专利文献1～3)，tfucas3由于是嗜热菌来源的，因而存在不适合在大量细胞的生长发育温度下利用这样的问题。另一方面，关于ecocas3，由于是大肠杆菌来源的，能够在与包含动物细胞在内的大量细胞的生长发育温度接近的温度范围发挥活性，因而具有适合可预计产业应用的大范围的生物的基因组编辑的性质，但即使要用现有的方法制造，也存在在维持活性的状态下高纯度且高浓度地纯化困难这样的问题(请参照后述的比较例1)。

5、现有技术文献

6、专利文献

7、专利文献1：国际公开2018/225858号公报

8、非专利文献

9、非专利文献1：huo y.et al.,nat.struct.mol.biol.2014sep；21(9):771-777

10、非专利文献2：mulepati s.&bailey s.,j.biol.chem.2013aug 2；288(31):22184-22192

11、非专利文献3：robert p.hayes et al.,nature 2016 530:499-503

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、本发明是鉴于上述现有技术所具有的问题而做出的，其目的是提供高纯度且高收率地制造能够在各种生物的基因组编辑中利用的cas3蛋白质的活性型的方法。

3、用于解决课题的手段

4、本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，大肠杆菌来源的cas3蛋白质热稳定性低，即使在通常的大肠杆菌的培养温度下培养而表达重组蛋白质的情况下，也变性而活性下降。

5、基于该意外的知识，本发明者们作为能够在比较低温培养的细胞选择了昆虫细胞，导入cas3基因并在各种温度条件进行了培养，结果发现，通过在20～28℃培养，从而cas3蛋白质有效地表达，并且其活性被维持。

6、另外，本发明者们进行了在昆虫细胞中表达的重组cas3蛋白质的纯化条件的研究，结果发现，通过在磷酸缓冲液中进行纯化，从而能够高纯度且高收量地回收重组cas3蛋白质的活性型。

7、进而，本发明者们发现，这样回收的重组cas3蛋白质在基因组编辑处理所需的比较短时间内，即使在动物细胞等的培养温度下也发挥高的活性，至此完成了本发明。

8、即，本发明涉及在维持活性的状态下高纯度且高浓度地制造能够在各种细胞的基因组编辑中利用的重组cas3蛋白质的方法，更详细地，提供以下的发明。

9、(1)cas3蛋白质的制造方法，该方法包括：

10、(a)将导入有cas3基因的昆虫细胞在20～28℃培养，在该昆虫细胞内使cas3蛋白质表达的工序，和

11、(b)回收所表达的cas3蛋白质的工序。

12、(2)根据(1)所述的方法，cas3蛋白质是大肠杆菌来源的。

13、(3)根据(1)或(2)所述的方法，昆虫细胞是sf9细胞。

14、(4)根据(1)～(3)的任一项所述的方法，所表达的cas3蛋白质的回收包括cas3蛋白质的纯化。

15、(5)根据(4)所述的方法，cas3蛋白质添加有标签，cas3蛋白质的纯化包括针对该标签的亲和纯化。

16、(6)根据(5)所述的方法，标签包含hn标签。

17、(7)根据(4)～(6)的任一项所述的方法，cas3蛋白质的纯化包括利用凝胶过滤层析的纯化。

18、(8)根据(4)～(7)的任一项所述的方法，纯化中使用的缓冲液是磷酸缓冲液。

19、发明的效果

20、根据本发明，能够高纯度且高收率地制造重组cas3蛋白质的活性型。本发明的方法能够在各种重组cas3蛋白质的制造中利用，特别是在对热稳定性低的cas3蛋白质应用中有用。

21、另外，根据本发明，在进行基因组编辑之前，可以以能够使用crispr-cas3系统的状态进行准备。进而，即使在难以将cas3作为基因导入使其表达的细胞、在以cas3作为重组蛋白质表达时得不到充分的基因组编辑的效率的细胞中，也能够有效地进行基因组编辑。因此，能够简便且通用地利用crispr-cas3系统。

技术特征：

1.cas3蛋白质的制造方法，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，cas3蛋白质是大肠杆菌来源的。

3.根据权利要求1或2所述的方法，昆虫细胞是sf9细胞。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，所表达的cas3蛋白质的回收包括cas3蛋白质的纯化。

5.根据权利要求4所述的方法，cas3蛋白质添加有标签，cas3蛋白质的纯化包括针对该标签的亲和纯化。

6.根据权利要求5所述的方法，标签包含hn标签。

7.根据权利要求4～6的任一项所述的方法，cas3蛋白质的纯化包括利用凝胶过滤层析的纯化。

8.根据权利要求4～7的任一项所述的方法，纯化中使用的缓冲液是磷酸缓冲液。

技术总结
发现了通过将导入了Cas3基因的昆虫细胞在比较低温培养，能够在维持活性的状态下有效地表达重组Cas3蛋白质，通过纯化该细胞的可溶化级分，能够高纯度且高收量地回收重组Cas3蛋白质的活性型。

技术研发人员：真下知士,吉见一人,竹下浩平,山本雅贵,涩村里美
受保护的技术使用者：C4U株式会社
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15