基于框架核酸和CRISPR的电化学传感器对病毒的检测方法

本发明涉及一种基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，属于病毒检测。

背景技术：

1、通过逆转录实时定量pcr(rt-qpcr)可测量病毒rna的数量，仍然是sars-cov-2病毒检测的标准技术。然而，无法获得rt-qpcr仪器、试剂和训练有素的仪器操作员会大大限制这种诊断工具的效用，特别是在资源有限的发展中国家。因此，快速、广泛、能够识别sars-cov-2检测的需求促使人们努力探索病毒rna检测的新策略。

2、目前，crispr/cas系统已成功应用于各类核酸检测中，主要利用溶液相的荧光分析技术。其主要原理是通过lwacas13a蛋白结合crrna识别靶标病毒片段，以激活lwacas13a蛋白的反式切割活性，对周围存在的rna荧光探针进行非特异性、非靶标性降解。使得rna探针两端的荧光基团和淬灭基团分离开，实现荧光信号的恢复。但是，目前荧光分析技术依赖特定的仪器，不能满足现场检测需求；此外，荧光信号易被游离的猝灭基团猝灭，使检测信号的丢失，造成假阴性结果，对真实检测结果容易形成误判。因此，急需发展快速、准确、便捷、稳定的检测方法和开发相关检测器件。

3、有鉴于此，确有必要提出一种病毒的检测方法，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，以解决现有技术中荧光分析技术依赖特定的仪器、检测信号易丢失的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，包括：

3、s1、制备带有电化学信号分子的框架核酸；

4、s2、对金电极进行预处理，并在金电极表面通过au-s键连接巯基修饰的发夹链sh-h1，以得到电化学传感界面；

5、s3、制备crispr/cas13a切割系统，并在所述crispr/cas13a切割系统中加入发夹h0；

6、s4、将所述电化学传感界面与s3得到的产物进行混合孵育，并加入发夹h2，在所述电化学传感界面进行cha反应；

7、s5、将s1的产物加入s4的产物中进行混合孵育，清洗后检测产物的电化学信号。

8、作为本发明的进一步改进，s1包括：

9、s11、制备dna纳米结构；

10、s12、结合dna纳米结构与电化学信号分子。

11、作为本发明的进一步改进，s11包括将dna骨架链和订书钉链通过沃森-克里克碱基互补配对组成dna纳米管；

12、s12包括将所述dna纳米管与电化学信号分子混合后摇晃孵育，以得到带有电化学分子信号的框架核酸。

13、作为本发明的进一步改进，所述电化学分子信号为亚甲基蓝、六氨合钌、道诺霉素中的任意一种或几种的组合。

14、作为本发明的进一步改进，所述crispr/cas13a切割系统包括待测物、能够与待测物特异性结合的crrna和与crrna特异性结合的lwacas13a蛋白，在缓冲溶液中，lwacas13a蛋白和crrna混合，形成crrna-cas13a复合物；加入待测物与crrna特异性结合，孵育形成三元复合物从而激活lwacas13a蛋白的反式切割活性。

15、作为本发明的进一步改进，所述发夹h0为含有部分rna链和部分cha引发链的发夹dna核酸链。

16、作为本发明的进一步改进，激活的lwacas13a蛋白将所述发夹h0切断以释放cha引发链。

17、作为本发明的进一步改进，在所述cha引发链的作用下，所述发夹h2与电化学传感界面上的发夹链sh-h1发生杂交互补，所述发夹h2包括一段能够与所述核酸框架结构互补的序列，以在所述电化学传感界面上连接所述带有电化学信号分子的框架核酸。

18、作为本发明的进一步改进，s5中使用方波脉冲伏安法测试清洗后的产物，若crispr/cas13a切割系统中包括靶标病毒的核酸片段，则产生强烈的电化学信号，若crispr/cas13a切割系统中不存在靶标病毒的核酸片段，则不会激活lwacas13a蛋白，电化学传感界面上不发生cha反应，不会产生强烈的电化学信号。

19、作为本发明的进一步改进，所述待测物包括口咽拭子、鼻咽拭子、唾液、血清中的任意一种或几种的组合。

20、本发明的有益效果是：本发明的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法是一种非酶扩增的核酸检测技术，可直接检测待测物中病毒的rna核酸片段；通过激活lwacas13a蛋白的反式切割活性，实现在电化学传感界面上催化发夹自组装，通过使用框架核酸来放大信号，使得该检测方法具有高灵敏度和特异性；通过在crispr/cas13a切割系统中设计不同的crrna，可以实现该检测方法对不同rna病毒基因片段的检测，具有优秀的可编程性和可拓展性。

技术特征：

1.一种基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于，s1包括：

3.根据权利要求2所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于：

4.根据权利要求2所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于：所述电化学分子信号为亚甲基蓝、六氨合钌、道诺霉素中的任意一种或几种的组合。

5.根据权利要求1所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于：所述crispr/cas13a切割系统包括待测物、能够与所述待测物特异性结合的crrna和与crrna特异性结合的lwacas13a蛋白，在缓冲溶液中，lwacas13a蛋白和crrna混合，形成crrna-cas13a复合物；加入待测物与crrna特异性结合，孵育形成三元复合物从而激活lwacas13a蛋白的反式切割活性。

6.根据权利要求5所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于：所述发夹h0为含有部分rna链和部分cha引发链的发夹dna核酸链。

7.根据权利要求6所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于：激活的lwacas13a蛋白将所述发夹h0切断以释放cha引发链。

8.根据权利要求7所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于：在所述cha引发链的作用下，所述发夹h2与电化学传感界面上的发夹链sh-h1发生杂交互补，所述发夹h2包括一段能够与所述核酸框架结构互补的序列，以在所述电化学传感界面上连接所述带有电化学信号分子的框架核酸。

9.根据权利要求1所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于：s5中使用方波脉冲伏安法测试清洗后的产物，若crispr/cas13a切割系统中包括靶标病毒的核酸片段，则产生强烈的电化学信号，若crispr/cas13a切割系统中不存在靶标病毒的核酸片段，则不会激活lwacas13a蛋白，电化学传感界面上不发生cha反应，不会产生强烈的电化学信号。

10.根据权利要求1所述的基于框架核酸和crispr的电化学传感器对病毒的检测方法，其特征在于：所述待测物包括口咽拭子、鼻咽拭子、唾液、血清中的任意一种或几种的组合。

技术总结
本发明提供了一种基于框架核酸和CRISPR的电化学传感器对病毒的检测方法，属于病毒检测技术领域。包括：S1、制备带有电化学信号分子的框架核酸；S2、对金电极进行预处理，并在金电极表面通过Au‑S键连接巯基修饰的发夹链SH‑H1，以得到电化学传感界面；S3、制备CRISPR/Cas13a切割系统，并在CRISPR/Cas13a切割系统中加入发夹H0；S4、将电化学传感界面与S3得到的产物进行混合孵育，并加入发夹H2，在电化学传感界面进行CHA反应；S5、将S1的产物加入S4的产物中进行混合孵育，清洗后检测产物的电化学信号。本发明的检测方法通过激活LwaCas13a蛋白的反式切割活性，实现在电化学传感界面上催化发夹自组装，通过使用框架核酸来放大信号，使得该检测方法具有高灵敏度和特异性。

技术研发人员：苏邵,汪联辉,马剑锋
受保护的技术使用者：南京邮电大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14