一种去除rRNA的探针组合物、建库试剂盒和建库方法与流程

本发明属于测序建库，具体地，涉及一种去除rrna的探针组合物、建库试剂盒和建库方法。

背景技术：

1、转录组(transcriptome)是指在某一特定的生理条件下，细胞、组织或者生物体内所有的转录产物的集合，即转录出来的所有rna总和，包括编码rna(主要是信使rna，即mrna)和非编码rna(ncrna)。mrna是一大类rna分子，它将遗传信息从dna传递到核糖体，并作为蛋白质合成模板决定基因表达产物蛋白质的序列。非编码rna包括转运rna(trna)、核糖体rna(rrna)、microrna(mirna)、长链非编码rna(lncrna)、环状rna(circrna)，目前的研究多集中在具有调控功能的small rna(以mirna为代表)、lncrna和circrna上，而这几类ncrna的调控对象都和mrna有关。核糖体rna(rrna)约占rna总量的80％，是含量最多的一类rna，通常这类rna分子量比较大且代谢不活跃，种类包括：原核生物的5s rrna、16s rrna和23s rrna，真核生物的5s rrna、5.8s rrna、18s rrna和28s rrna。

2、随着新一代测序平台的市场化，rna测序(rna sequencing，rna-seq)技术已成为了转录组学研究的重要手段之一。该技术利用新一代高通量测序平台对基因组cdna测序，通过统计相关reads(用于测序的cdna小片段)数计算出不同mrna的表达量，分析转录本的结构和表达水平，同时发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及编码序列单核苷酸多态性，提供最全面的转录组信息。转录组测序技术流程主要包括样品制备、文库构建、dna成簇扩增、高通量测序和数据分析，相对于传统的芯片杂交平台，rna-seq技术具有诸多独特优势，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号、更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组的强大工具。

3、由于rrna在总rna中含量丰富，直接对总rna进行测序会检测到过多的rrna而掩盖其它编码基因的表达丰度，通常的策略是在测序之前从总rna中去除rrna，因而rrna去除的效率决定了转录组测序能否最大化读取到样品转录产物的信息。

4、目前，从样品总rna中去除rrna的商品化试剂盒方法包括ribo-zero(epicentre)，ribo-minus(thermofisher scientific)，nebnext rrna depletion kits(neb)等，它们虽然都能去除大部分rrna，但是其方法成本、rna投入量要求较高，操作繁琐，耗时等。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在提供一种直接、可靠的方法，实现高效率、低成本rrna去除，显著提高目标rna分子(mrna、lncrna、circrna等)检测的特异性和准确度，从而能在样品中发掘利用到更多有用的转录组信息。为此，本发明采用的技术方案如下：

2、本发明第一方面提供一种去除rrna的探针组合物，所述探针组合物包括seq idno.1～seq id no.101所示的探针。

3、在本发明中，所述探针组合物中的探针根据rrna序列进行设计，能够特异性与rrna进行杂交，杂交后通过核糖核酸酶进行消化，达到去除rrna的目的。

4、本发明第二方面提供本发明第一方面所述的探针组合物在制备用于去除rrna的测序建库试剂盒中的应用。

5、由于上述探针组合物能够用于去除rrna，因此，所述探针组合物可以用于制备测序建库试剂盒，利用探针组合物去除rrna后，结合其他测序建库试剂，能够显著提高目标rna分子(mrna、lncrna、circrna等)检测的特异性和准确度，从而能在样品中发掘利用到更多有用的转录组信息。

6、本发明第三方面提供一种用于去除rrna的测序建库试剂盒，，所述测序建库试剂盒包括本发明第一方面所述的探针组合物。

7、在本发明的一些实施方案中，所述测序建库试剂盒中，将所述探针组合物配制成探针溶液，所述探针溶液中各探针的浓度为0.5μmol/l。当然，本发明中，探针溶液中各探针的浓度也可以不相同，可能根据目标rrna的含量进行调整。

8、在本发明的一些实施方案中，所述测序建库试剂盒中还包括rnase h。rnase h是指核糖核酸酶h，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解dna-rna杂合链中的rna。rnaseh不能水解单链或双链dna或rna中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链dna或rna。

9、在本发明的一些实施方案中，所述测序建库试剂盒中还包括dnase i、片段化试剂、双链cdna合成试剂和/或核酸纯化试剂。其中，dnase i(deoxyribonuclease i)中文名称为脱氧核糖核酸酶i，是一种可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。

10、本发明第四方面提供一种去除rrna的测序建库方法，包括以下步骤：

11、s1，获得待测序生物样本的总rna样本，

12、s2，将所述总rna样本与权利要求1所述的探针组合物进行杂交，并利用rnase h消化；

13、s3，将rna样本进行片段化和cdna合成，构建测序文库。

14、在本发明的一些实施方案中，步骤s2中，将所述总rna样本与所述探针组合物进行杂交后，按以下程序进行杂交：95℃，2min；95-22℃，0.1℃/sec；22℃，5min。

15、在本发明的一些实施方案中，在步骤s2之后，步骤s3之前，进一步包括利用dnasei消化的步骤。

16、在本发明中，所述待测序生物样本为哺乳动物组织样本。

17、本发明的有益效果

18、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

19、本发明的探针组合物能够特异性与rrna杂交，能够实现高效率、低成本rrna去除，显著提高目标rna分子(mrna、lncrna、circrna等)检测的特异性和准确度，从而能在样品中发掘利用到更多有用的转录组信息。

技术特征：

1.一种去除rrna的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括seq id no.1～seqid no.101所示的探针。

2.权利要求1所述的探针组合物在制备用于去除rrna的测序建库试剂盒中的应用。

3.一种用于去除rrna的测序建库试剂盒，其特征在于，所述测序建库试剂盒包括权利要求1所述的探针组合物。

4.根据权利要求3所述的测序建库试剂盒，其特征在于，所述测序建库试剂盒中，将所述探针组合物配制成探针溶液，所述探针溶液中各探针的浓度为0.5μmol/l。

5.根据权利要求3所述的测序建库试剂盒，其特征在于，还包括rnase h。

6.根据权利要求3-5任一所述的测序建库试剂盒，其特征在于，还包括dnase i、片段化试剂、双链cdna合成试剂和/或核酸纯化试剂。

7.一种去除rrna的测序建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的测序建库方法，其特征在于，步骤s2中，将所述总rna样本与所述探针组合物进行杂交后，按以下程序进行杂交：95℃，2min；95-22℃，0.1℃/sec；22℃，5min。

9.根据权利要求7所述的测序建库方法，其特征在于，在步骤s2之后，步骤s3之前，进一步包括利用dnase i消化的步骤。

10.根据权利要求7-9任一所述的测序建库方法，其特征在于，所述待测序生物样本为哺乳动物组织样本。

技术总结
本发明公开了一种去除rRNA的探针组合物、建库试剂盒和建库方法，属于测序建库技术领域。所述探针组合物包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.101所示的探针。本发明的探针组合物能够特异性与rRNA杂交，能够实现高效率、低成本rRNA去除，显著提高目标RNA分子(mRNA、lncRNA、circRNA等)检测的特异性和准确度，从而能在样品中发掘利用到更多有用的转录组信息。

技术研发人员：蔡霖霖,殷楠楠,陆幽兰,李闪
受保护的技术使用者：杭州联川生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11