一种水生动物体内溶藻弧菌的鉴定方法

本发明涉及一种水生动物体内溶藻弧菌的鉴定方法。

背景技术：

1、水生生物是优质蛋白质来源，富含人体所需的各种氨基酸和丰富的多不饱和脂肪酸，有益于国民身体健康，深受广大消费者的青睐。随着我国水产养殖行业日益发展，水产养殖的疾病问题也日益增多，复杂的水体环境使水产养殖生物体内常会滋生一些致病性微生物，如果这些致病微生物残留，富集在水产养殖生物体内就会严重危害食用者的健康。

2、溶藻弧菌是众多致病性微生物中较为常见的一种，它是一种嗜盐性细菌，主要来自海产养殖鱼类，存活能力强，海水中可存活1个月。食物中毒一般表现为急发病，主要症状为不同程度的头痛、头晕、乏力和腹痛、腹泻、恶心等消化道症状。

3、目前，使用传统的检测方法，即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确，但费力、耗时，一般需4-7d才能完成，这对水产养殖急发性疾病的处理是不现实的。而基因扩增的方式进行检测就需要高度的特异性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种水生动物体内溶藻弧菌的鉴定方法，特异性强、灵敏度高、时间短。

2、本发明的第一个方面是提供一种用于溶藻弧菌鉴定的引物对，所述引物对为引物对1、引物对2或引物对3；其中，引物对1：上游引物tgatgtgattgcgttggta；下游引物gcgaactaacttatggaactc；引物对2：上游引物tgatgtgattgcgttggta；下游引物cgaactaacttatggaactctc；引物对3：上游引物atgtgattgcgttggtaga；下游引物cgaactaacttatggaactctc。

3、本发明的第二个方面是提供一种用于微藻鉴定的引物组，所述引物组含有引物对1、引物对2和引物对3中的两种或以上；其中，引物对1：上游引物tgatgtgattgcgttggta；下游引物gcgaactaacttatggaactc；引物对2：上游引物tgatgtgattgcgttggta；下游引物cgaactaacttatggaactctc；引物对3：上游引物atgtgattgcgttggtaga；下游引物cgaactaacttatggaactctc。

4、本发明的第三个方面是提供一种含有本发明第一个方面所述引物对、或本发明第二个方面所述引物组的试剂盒。

5、本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的引物对、或者本发明第二个方面所述的引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒在鉴定或区分溶藻弧菌中的应用。

6、本发明的第五个方面是提供一种水生动物体内溶藻弧菌的鉴定方法，采用本发明第一个方面所述的引物对、或者本发明第二个方面所述的引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒进行。

7、优选地，所述的鉴定方法包括以下步骤：(1)溶藻弧菌阳性标本制备：取溶藻弧菌原液注射至的水生动物体(比如罗非鱼腹腔等)中，培养成为人为模拟的阳性标本；(2)溶藻弧菌菌株培养：分别取阳性标本和待测样本的内脏(肠道、肾脏、肝脏等)，加入到培养基中进行培养；(3)溶藻弧菌dna提取：从步骤(2)中菌液提取dna；(4)采用本发明第一个方面所述的引物对、或者本发明第二个方面所述的引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒进行pcr扩增，对扩增产物进行测序或凝胶电泳，将阳性标本和待测样本的检测结果进行比较即可判断待测样本中是否感染溶藻弧菌。

8、优选地，所述的鉴定方法包括以下步骤：(1)取待测样本的内脏，培养后提取dna；(2)采用本发明第一个方面所述的引物对、或者本发明第二个方面所述的引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒进行pcr扩增，对扩增产物进行测序或凝胶电泳，通过是否检测到相应大小的目标片段或目标条带即可判断水生动物体内是否携带有溶藻弧菌；其中，引物对1对应的目标片段或目标条带为130bp，引物对2对应的目标片段或目标条带为129bp，引物对3对应的目标片段或目标条带为127bp。

9、本发明的第六个方面是提供一种区分溶藻弧菌的方法，采用本发明第一个方面所述的引物对、或者本发明第二个方面所述的引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒进行。

10、优选地，所述方法包括以下步骤：(1)提取溶藻弧菌和待测菌株的dna；(2)采用本发明第一个方面所述的引物对、或者本发明第二个方面所述的引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒进行pcr扩增，对扩增产物进行测序或凝胶电泳，将待测样本和溶藻弧菌的检测结果进行比较即可判断待测样本中是否为溶藻弧菌。

11、优选地，所述方法包括以下步骤：(1)提取待测菌株的dna；(2)采用本发明第一个方面所述的引物对、或者本发明第二个方面所述的引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒进行pcr扩增，对扩增产物进行测序或凝胶电泳，通过是否检测到相应大小的目标片段或目标条带即可判断待测菌株是否为溶藻弧菌；其中，引物对1对应的目标片段或目标条带为130bp，引物对2对应的目标片段或目标条带为129bp，引物对3对应的目标片段或目标条带为127bp。

12、本发明的有益效果是：

13、本发明提供了特异性引物对，可用于水生生物体内的溶藻弧菌pcr检测，特异性强、灵敏度高、时间短，能够很好满足人们对水生动物疾病的检测，并且这种方法对于其他致病微生物的检测具有指导意义。

技术特征：

1.一种用于溶藻弧菌鉴定的引物对，其特征在于，所述引物对为引物对1、引物对2或引物对3；其中，

2.一种用于微藻鉴定的引物组，其特征在于，所述引物组含有引物对1、引物对2和引物对3中的两种或以上；其中

3.一种含有权利要求1所述引物对、或权利要求2所述引物组的试剂盒。

4.如权利要求1所述的引物对、或者权利要求2所述的引物组、或者权利要求3所述的试剂盒在鉴定或区分溶藻弧菌中的应用。

5.一种水生动物体内溶藻弧菌的鉴定方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物对、或者权利要求2所述的引物组、或者权利要求3所述的试剂盒进行。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.一种区分溶藻弧菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物对、或者权利要求2所述的引物组、或者权利要求3所述的试剂盒进行。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明提供了一种用于溶藻弧菌鉴定的引物对，所述引物对为引物对1、引物对2或引物对3；其中，引物对1：上游引物TGATGTGATTGCGTTGGTA；下游引物GCGAACTAACTTATGGAACTC；引物对2：上游引物TGATGTGATTGCGTTGGTA；下游引物CGAACTAACTTATGGAACTCTC；引物对3：上游引物ATGTGATTGCGTTGGTAGA；下游引物CGAACTAACTTATGGAACTCTC。所述引物对可用于水生生物体内的溶藻弧菌PCR检测，特异性强、灵敏度高、时间短，能够很好满足人们对水生动物疾病的检测，并且这种方法对于其他致病微生物的检测具有指导意义。

技术研发人员：邓晓东,刘思航,费小雯,张秀霞
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院热带生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16