高产ApxI毒素的APP菌株、其构建方法及应用

本发明涉及微生物领域，具体涉及高产apxi毒素的app菌株、其构建方法及应用。

背景技术：

1、胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae，app)是引起猪传染性胸膜肺炎的主要病原，它是一种革兰氏阴性短杆菌，具有荚膜和菌毛，无运动性，不能形成芽孢。app通过呼吸道进入猪体内，然后直接通过气管和支气管进入肺泡，引发出血性和坏死性肺炎、纤维素性胸膜炎。根据app表面可溶性抗原(主要为荚膜多糖和脂多糖)的差异性，将app分为15个血清型，不同血清型菌株的毒力存在显著的差异。

2、鉴于猪传染性胸膜肺炎在世界各地广泛流行和传播并造成较大的经济损失，采取积极防治措施控制该病极为必要。虽然抗生素药物防治对控制该病具有重要作用，但app对许多抗生素易产生耐药性，因此疫苗免疫仍是防治该病的有效手段。研制安全有效的app疫苗成为研究领域关注的焦点。近年来，针对猪传染性胸膜肺炎研发的疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗。app全菌灭活疫苗是应用最广泛、最成熟的一种防治猪传染性胸膜肺炎的疫苗，但是灭活疫苗的效果并不十分理想，不能刺激机体产生高滴度的抗体。当免疫过的猪只受到感染后，也会出现临床症状和肺部损伤。并且app各血清型的灭活疫苗之间不能提供有效的交叉保护。商品化的胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗主要以从培养上清中提取的apx毒素为主要成分，使用后能对多种血清型产生比较显著的免疫效果。由于常规亚单位疫苗制备需要从胸膜肺炎放线杆菌培养上清中提取抗原，但抗原分泌表达量少，生产成本较高，进而影响了其价格和应用性。而以基因工程方法原核表达纯化的抗原，由于抗原自身分子量较大，不能可溶性表达，制备的抗原并非天然构象，进而影响免疫效果。

技术实现思路

1、为满足上述领域的需求，本发明提供一株胸膜肺炎放线杆菌，其保藏编号为cgmccno.25495，名称为4074-oxyr。

2、所述胸膜肺炎放线杆菌(4074-oxyr)是以野生型app血清1型参考菌株(4074)为出发菌株，经oxyr基因突变并导入apxia基因表达载体而获得的高产apxi毒素的菌株，其apxi毒素产量为2.367±0.25mg/l，是野生型菌株apxi毒素产量的3倍多。

3、本发明还提供一种菌剂，其包含上述胸膜肺炎放线杆菌(4074-oxyr)。

4、所述菌剂可为固体菌剂或液体菌剂。

5、所述胸膜肺炎放线杆菌(4074-oxyr)在制备apxi毒素中的应用也属于本发明的保护范围。

6、所述胸膜肺炎放线杆菌(4074-oxyr)在制备胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

7、本发明还提供一种构建高产apxi毒素的胸膜肺炎放线杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8、a)使胸膜肺炎放线杆菌中的oxyr基因失活，获得oxyr基因突变菌株；

9、b)构建所述胸膜肺炎放线杆菌的apxia基因的表达载体并将所述表达载体导入所述oxyr基因突变菌株中，获得高产apxi毒素的基因工程菌株。

10、在所述方法的一些实施例中，所述步骤a)包括：

11、a1)将核苷酸序列如seq id no：2所示的目的片段1导入接合转移质粒pemoc2中，得到第一重组质粒；

12、a2)将核苷酸序列如seq id no：4所示的目的片段2导入所述第一重组质粒中，得到第二重组质粒；

13、a3)将所述第二重组质粒导入大肠杆菌β2155中，得到供体菌；

14、a4)通过接合转移将所述第二重组质粒从所述供体菌导入所述胸膜肺炎放线杆菌中。

15、在所述方法的一些实施例中，所述第二重组质粒的核苷酸序列如seq id no：5所示。

16、在所述方法的一些实施例中，所述apxia基因的核苷酸序列如seq id no：10所示。

17、在所述方法的一些实施例中，所述胸膜肺炎放线杆菌为胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株。

18、本发明为高产apxi毒素菌株的构建提供了一种新的思路和方法，为胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗的生产提供了新的菌株资源。

19、本发明提供的高产apxi毒素的胸膜肺炎放线杆菌的专利保藏信息如下：

20、生物材料(株)：4074-oxyr

21、分类命名：actinobacillus pleuropneumoniae

22、保藏日期：2022年08月05日

23、保藏编号：cgmcc no.25495

24、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)

25、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

技术特征：

1.一株胸膜肺炎放线杆菌，其保藏编号为cgmcc no.25495。

2.一种菌剂，其特征在于，其包含权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

4.权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌在制备apxi毒素中的应用。

5.权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌在制备胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗中的应用。

6.构建高产apxi毒素的胸膜肺炎放线杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤a)包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二重组质粒的核苷酸序列如seq idno：5所示。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述apxia基因的核苷酸序列如seq idno：10所示。

10.根据权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述胸膜肺炎放线杆菌为胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株。

技术总结
本发明涉及微生物领域，具体涉及高产ApxI毒素的APP菌株、其构建方法及应用。本发明提供一株胸膜肺炎放线杆菌，其保藏编号为CGMCC No.25495。所述胸膜肺炎放线杆菌的ApxI毒素产量高达2.367±0.25mg/L，是野生型菌株ApxI毒素产量的3倍多。本发明为高产ApxI毒素菌株的构建提供了一种新的思路和方法，为胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗的生产提供了新的菌株资源。

技术研发人员：郭芳芳,徐福洲,崔一芳,王菁
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14