一种美法仑杂质D的纯化方法与流程

本发明涉及药物纯化，特别涉及一种美法仑杂质d的纯化方法。

背景技术：

1、美法仑(melphalan)是氮芥类化疗药物，别名:米尔法兰、l-溶肉瘤素。是苯丙氨酸氮芥的左旋体，是一种烷化剂，由于其结构的物异性，使其可进入肿瘤细胞内而发生作用，导致细胞死亡，从而起到抗肿瘤作用。与其他烷化剂相同，与dna及rna发生交叉联结，导致肿瘤细胞死亡，为细胞周期非特异性药物。谷胱甘肽水平提高，药物运转减慢，dna修复增强，可导致耐药性增加。可用与治疗多种肿瘤疾病，包括多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、慢性白血病以及甲状腺癌等。还可动脉灌注用于治疗恶性黑色素瘤、骨肉瘤及软组织肉瘤等肢体恶性肿瘤。

2、而药物中含有的杂质是影响药物纯度的主要因素，如药物中含有超过限量的杂质，就有可能使理化常数变动，外观性状产生变异，并影响药物的稳定性；杂质增多也必然使药物的含量偏低或活性降低，毒副作用显著增加。因此，杂质对照品的纯度对药物的质量控制起到关键性的作用。所以对于美法仑的原料和制剂的质量控制，必须有质量合格的杂质对照品。

3、目前，国内外研究多集中在临床应用和衍生物的合成上，对美法仑的杂质研究较少。本发明涉及的(s)-2-氨基-3-(4-((2-氯乙基)(2-羟乙基)氨基)苯基)丙酸即美法仑杂质d作为美法仑的一个重要杂质对照品之一，目前无法检索到美法仑杂质d的相关纯化方法。而常规有机合成制得的美法仑杂质d粗品可能会有较高的初始纯度，但是该粗品含有大量的无机盐混杂，该样品由于含量虚高会产生较大的校正因子偏差，同时受到盐潮解吸收水汽的影响，该样品极易降解(式1)。

4、

5、如现合成的样品现制现测时检测纯度为97.8％。放置约15min后纯度下降至97.1％并观察到保留时间为4.2min的杂质峰面积增加约1％。而进一步放置3h后纯度明显下降，检测纯度值为91％，6h后纯度下降至88％，4.2min的降解产物则对应增加(如附图2)。甚至进一步延长实验时间至72小时后，溶液中的美法仑ep杂质d几乎完全分解，4.2min左右的降解杂质成为主产物。

6、随着美法仑杂质d放置时间的延长，主峰纯度持续降低，这极大限制了该样品的纯化和使用，同时对产品的纯化提出了较高的要求。本发明提供了一种针对美法仑杂质d的纯化的简单易行的方法。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供一种美法仑杂质d的纯化方法。本发明提供一种美法仑杂质d的制备纯化路线，为美法仑原料药及其制剂的杂质分析及研究提供了便利，为美法仑的生产和用药安全提供检测方法及判定依据

2、为了实现上述目的，本发明提供一种美法仑杂质d的纯化方法，包括如下步骤：

3、步骤s1：配制流动相a、流动相b、稀释剂、样品液；

4、步骤s2：运用制备型高效液相色谱对样品液进行纯化，

5、条件如下：流速：10ml/min～40ml/min；柱温：10c～30℃；进样量:1～5ml；检测波长：200nm～220nm；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；

6、步骤s3：通过调节梯度洗脱中有机相的比例，进行梯度洗脱：

7、步骤s4：取样品溶液，注入制备高效液相色谱仪中，然后按照面积归一法，以样品色谱图中各色谱峰峰面积百分比进行计算。

8、优选的，所述步骤s3中洗脱梯度为：

9、在0到6min阶段，流动相a:流动相b为95:5～80:20；

10、在6到12min阶段，流动相a:流动相b为80:20～70:30；

11、在12min到18min阶段，流动相a:流动相b为70:30～60:40；

12、在18min到24min阶段，流动相a:流动相b为60:40～60:40；

13、在24min到26min阶段，流动相a:流动相b为60:40～5:95；

14、在26min到30min阶段，流动相a:流动相b为5:95～5:95。优选的，所述步骤s1中的流动相a选自经0.22um微孔过滤膜过滤的超纯水。

15、优选的，所述步骤s1中的流动相b选自色谱级乙睛。

16、优选的，所述步骤s1中的样品液的配制：称取美法仑杂质d，加稀释剂超声溶解至澄清溶液。

17、优选的，所述步骤s1中的稀释剂选自超纯水。

18、优选的，所述步骤s2中的流速：25ml/min；柱温：25℃；检测波长：210nm。

19、采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：

20、在本技术发明中，梯度洗脱中有机相含量对美法仑杂质d的纯化有很大的影响。通过不同的比例组成进行梯度洗脱，可以达到美法仑杂质d与其他杂质的有效分离。最后确认梯度洗脱为在0到6min，流动相a:b为95:5～80:20；在6到12min，流动相a:b为80:20～70:30；在12min到18min，流动相a:b为70:30～60:40；在18min到24min，流动相a:b为60:40～60:40；在24min到26min，流动相a:b为60:40～5:95；在26min到30min，流动相a:b为5:95～5:95此梯度条件下进行洗脱，美法仑杂质d能分离出更多的杂质，仍能保持较好的分离度，分离度均大于1.5，符合要求。并且该梯度条件下，将单次纯化量由10mg/ml增加至100mg/ml，同样能得纯度≥95％的美法仑杂质d产品，样品峰与其他杂质分离度为1.61，符合要求，该方法操作简单，成本低。相较于目前国内外对美法仑杂质d纯化研究的空缺，本发明能为美法仑杂质d对照品的产品质量提供良好的方法。进而有效控制美法仑产品质量，为美法仑原料药及其制剂的杂质分析及研究提供便利，为美法仑的生产和要用安全提供检测方法和判断依据。

技术特征：

1.一种美法仑杂质d的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的美法仑杂质d的纯化方法，其特征在于，所述步骤s1中的流动相a选自经0.22um微孔过滤膜过滤的超纯水。

3.根据权利要求2所述的美法仑杂质d的纯化方法，其特征在于，所述步骤s1中的流动相b选自色谱级乙睛。

4.根据权利要求3所述的美法仑杂质d的纯化方法，其特征在于，所述步骤s1中的样品液的配制：称取美法仑杂质d，加稀释剂超声溶解至澄清溶液。

5.根据权利要求4所述的美法仑杂质d的纯化方法，其特征在于，所述步骤s1中的稀释剂选自超纯水。

6.根据权利要求1所述的美法仑杂质d的纯化方法，其特征在于，所述步骤s2中的流速：25ml/min；柱温：25℃；检测波长：210nm。

7.根据权利要求1所述的美法仑杂质d的纯化方法，其特征在于，所述步骤s3中洗脱梯度为：

技术总结
本发明公开一种美法仑杂质D的纯化方法，包括如下步骤：配制流动相A、流动相B、稀释剂、样品液；运用制备型高效液相色谱对样品液进行纯化，条件如下：流速：10mL/min～40mL/min；柱温：10C～30℃；进样量:1～5ml；检测波长：200nm～220nm；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；通过调节梯度洗脱中有机相的比例，进行梯度洗脱；取样品溶液，注入制备高效液相色谱仪中，然后按照面积归一法，以样品色谱图中各色谱峰峰面积百分比进行计算。本发明的梯度洗脱中有机相含量对美法仑杂质D的纯化有很大的影响。通过不同的比例组成进行梯度洗脱，可以达到美法仑杂质D与其他杂质的有效分离。

技术研发人员：李吉平,邱富强,陈斌,徐阳进,李洋
受保护的技术使用者：深圳振强生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12