一种特异性检测槟榔黄化植原体的巢式引物组、试剂盒及其检测方法

本发明涉及生物，具体而言，本发明涉及一种新的用于特异性检测槟榔黄化植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、槟榔(areca catechul.)为棕榈科槟榔属单一生长点常绿乔木。槟榔是重要的药用植物，为我国四大南药之首，其果实具有固齿杀菌、消积化食、消脚气及驱虫等功效。除了具有良好的药用价值，槟榔还逐渐成了人们继香烟、酒和含咖啡因饮料后的咀嚼嗜好品，受到广大消费者的喜爱。目前世界上爱吃槟榔的人大概有10到12亿人，其中中国有1亿人。槟榔由于其良好的药用价值和嗜好品用途，随着越来越多的人对槟榔认识加深，并喜爱和消费，市场需求不断扩大，产业前景广阔。

2、槟榔黄化病是一种槟榔致死侵染性病害，此病于1914年首次在印度发现，1981年在我国海南屯昌县也相继出现，随后至今，槟榔黄化病几乎已经蔓延至印度和我国海南的几乎所有的槟榔种植区，其他国家的槟榔种植区也有少量发生。槟榔黄化病的典型症状为：发病初期，植株倒数2～3片叶的小叶叶尖首先表现黄化，随后黄化症状逐年加重，最终整株叶片黄化，干旱季节黄化症状更加明显；整株叶片无法正常展开，导致树冠变小；腋芽水渍状，暗黑色，基部有浅褐色夹心；花穗短小，无法正常展开；结少量黑色果实，不能食用；大部分植株发病5～7年后枯顶死亡。

3、由植原体(phytoplasma)引起的槟榔黄化病是是我国海南槟榔生产上的一种毁灭性病害，植原体是一类寄生于植物韧皮部、尚不能分离纯化的原核致病菌，难以人工培养。此外，植原体在木本植物中含量低、分布不均且浓度随季节而变化，导致难以检测。目前植原体检测方法有巢氏pcr(nested-pcr)技术、实时荧光定量pcr(real-time pcr)技术、环介导等温扩增和微滴式数字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)技术等，其中巢氏pcr技术最常用。巢氏pcr引物设计依据植原体保守的16srdna序列，其中r16mf2/r16mr1和r16mf2n/r16mr2是检测植原体的通用引物。此外，随着p1/p7引物设计成功，利用p1/p7与上述两对引物结合也是常用的技术。迄今，在槟榔叶片、花苞、根部、花序等组织中都能检测到植原体。因此，高灵敏度、高效快速的植原体检测方法的建立在植原体病害各方面的研究中都至关重要，特别是在病害监测、种苗检疫及综合防治方面占据着无法替代的地位并发挥着关键作用。

4、然而，在利用植原体的通用引物对槟榔黄化现象的植株进行巢式pcr检测时，普遍存在通用引物对其不特异，以及即使大小与预期一致，通过对pcr片段测序证实为非植原体的假阳性序列。总之目前急需一种针对槟榔黄化植原体的特异性检测技术。

5、而其他的检测方法中(实时荧光定量pcr技术、环介导等温扩增和微滴式数字pcr)，虽然检测的灵敏度比较高，但其在检测过程中所使用的试剂和耗材相对于巢式pcr而言，价格都普遍昂贵，造成检测成本较高，且需要使用专用仪器进行检测(仪器价值也比较昂贵)，难以推广和普及，给槟榔黄化植原体的检测带来极大的不便。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺陷，解决植原体通用引物在检测槟榔黄化植原体时出现条带大小一致的非特异性条带，以及大量假阳性序列的问题，本发明提供一组新的槟榔黄化植原体高效分子检测引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的槟榔黄化病的巢式分子检测方法，所述方法可快速、准确的检测与鉴定植原体所造成的槟榔黄化病。具体的，本发明提供如下的技术方案：

2、本发明的第一个方面，提供一种特异性的巢式pcr引物组，该引物组是针对发明人利用高通量测序技术获得的一段新发现的槟榔黄化病植原体的特异序列(如seq id no.1所示)设计的。

3、所述巢式pcr引物组由第一轮扩增的上游引物(序列如p_n1-f所示)，第一轮扩增的下游引物(序列如p_n1-r所示)，第二轮扩增上游引物(p_n2-f3所示)，第二轮扩增下游引物(p_n2-r3所示)组成，具体的，所述引物对序列如下所示：

4、第一轮扩增上游引物：5′-tgcaataacgcgtgctaaac-3′(p_n1-f)

5、第一轮扩增下游引物：5′-aaacgtttccttacttgcccc-3′(p_n1-r)

6、第二轮扩增上游引物：5′-cgcgtgctaaacatgatattga-3′(p_n2-f3)

7、第二轮扩增下游引物：5′-tgtgaagaatctcgataatgcct-3′(p_n2-r3)

8、本发明的第二个方面，提供一种用于快速、高效检测剑槟榔黄化植原体的试剂盒，其包含本发明的第一个方面所述的新的巢式pcr引物组。即本发明的第二个方面的试剂盒中包含具有p_n1-f和p_n1-r、p_n2-f3和p_n2-r3所示的核苷酸的巢式pcr引物组。所述试剂盒中还包括pcr反应试剂。

9、本发明的第三个方面，提供如第一个方面所述的引物对或本发明第二个方面所述的试剂盒在高效检测槟榔黄化植原体中的应用。

10、本发明的第四个方面，提供一种用于高效检测槟榔黄化植原体的方法，该方法包括使用本发明第一个方面所述的巢式pcr引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物对进行巢氏pcr扩增的步骤。

11、进一步地，所述pcr方法包括以下步骤：

12、步骤1，从样品中提取基因组dna：

13、步骤2，使用第一个方面所述的巢式pcr引物组或者本发明的第二个方面所述的试剂盒中的引物对进行巢式pcr扩增；

14、步骤3，比较扩增产物大小，并进行测序比对。

15、本发明中，提取待测样品的基因组dna的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组dna提取方法或试剂盒进行。

16、本发明中，将所述待测样品的基因组dna进行巢式pcr扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述的巢式pcr扩增的反应体系为如下表：

17、

18、所述pcr第一轮扩增的反应条件为：

19、

20、所述pcr第二轮扩增的反应条件为：

21、

22、

23、本发明中，步骤3中若检测出现583bp左右的特异性条带则判断为检出槟榔黄化植原体。

24、本发明的引物组是通过对槟榔黄化植原体感染的样品材料和健康的槟榔样品材料进行高通量测序，并对非槟榔基因组的序列在ncbi数据库中blast比对分析，从而获得的一段特异性的保守序列(如图1所示)，最后通过使用primer primer5软件设计退火温度保持在56摄氏度左右的pcr引物组。

技术特征：

1.一种特异性检测槟榔黄化植原体的巢式引物组，其特征在于，所述引物组可用于扩增槟榔黄化植原体的583bp左右的特异性序列，所述巢式pcr引物组由第一轮扩增的上游引物，第一轮扩增的下游引物，第二轮扩增上游引物，第二轮扩增下游引物组成，其中，所述引物对序列如下所示：

2.一种用于检测剑槟榔黄化植原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的巢式pcr引物组。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括pcr反应试剂。

4.如权利要求1所述的引物组或如权利要求2或3所述的试剂盒在高效检测槟榔黄化植原体中的应用。

5.一种用于高效检测槟榔黄化植原体的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求1所述的巢式引物组或如权利要求2或3所述的试剂盒进行巢氏pcr扩增的步骤。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述巢式pcr扩增包括以下步骤：

技术总结
本发明提供一组新的槟榔黄化植原体高效分子检测引物对以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的槟榔黄化病的巢式分子检测方法，所述方法可快速、准确的检测与鉴定植原体所造成的槟榔黄化病。

技术研发人员：张晓明,康乐,王乾,宋双伟
受保护的技术使用者：中国科学院动物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13