具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞及其制备方法和应用与流程

本发明涉及细胞生物学，具体涉及一种具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

1、皮肤老化是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。皮肤衰老机理可分为内源性衰老和外源性衰老，而皮肤的衰老过程是二者共同作用的结果。紫外线辐照、恶劣的环境等外源因素通过促进内源性因素的影响而加速了衰老的进程；内源性老化是遗传因素控制和自由基对细胞的损伤等共同作用形成，皮肤随年龄增长的自然老化，表现为皮肤薄，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等；外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化，表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。例如皱纹形成的机理主要包括：(1)角质层功能低下，水分量低下；(2)表皮劣质化，表皮细胞的增殖活性衰退；(3)真皮胶原蛋白纤维的减少、胶原蛋白纤维束构造紊乱以及紫外线引起的mmp活化或增多，导致胶原蛋白的分解和断裂；(4)弹性蛋白变性，紫外线照射使弹性蛋白酶活化，弹性纤维断裂、流失；(5)透明质酸减少；(6)基底膜损伤，长时间紫外线照射使表皮基底细胞中会产生明胶酶(mmp-2-9)，破坏基底膜；(7)表皮乙酰肝素酶活化变高，可显著分解乙酰肝素，会导致被硫酸乙酰肝素所控制的增殖因子的制御混乱，引起表皮、真皮以及血管、淋巴管的损伤，促进皱纹等光老化的产生；(8)血管新生，紫外线导致表皮中凝血酶敏感蛋白和血管内增殖因子的平衡紊乱，诱导血管新生，接着弹性蛋白酶以及生成mmp的中性白血球浸润到皮肤组织中，使弹性蛋白酶和胶原蛋白分解、变性产生皱纹；(9)淋巴管回收功能低下，紫外线使淋巴管活化因子(vegfc)减少，作为炎症细胞的巨噬细胞的回收迟缓，停留在真皮内，结果促进由巨噬细胞中的mmp-12(弹性蛋白酶)引起的弹性蛋白的分解，皱纹生成；(10)活性氧、自由基生成，引起细胞膜等的过氧化脂质以及由胶原蛋白纤维和弹性纤维的关联等造成的蛋白变性、活性氧去除酶群的不活化、dna损伤和mmp-1,3,9活化，导致真皮构造变性，细胞功能低下，皱纹生成。

2、干细胞在组织修复方面也发挥一定的作用，但是现有培养的干细胞在组织修复方面的作用比较单一，不能从多方面来修复组织如不能很好的修复皮肤光老化问题，因此，提供一种能从多角度修复皮肤光老化的干细胞及制备方法是非常有意义的。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞及其制备方法和应用，以解决现有技术中干细胞修复组织功能单一的问题。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞的制备方法，包括：

3、获取组织，然后分离原代干细胞，对原代干细胞进行贴壁培养至融合度为80％以上后，采用胰蛋白酶消化贴壁细胞，然后用细胞培养基终止后，制得具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞。

4、本发明的有益效果为：本发明制备的间充质干细胞可通过组织修复与再生能力和旁分泌生长因子与抗炎因子对紫外损伤后的成纤维细胞和m0巨噬细胞起到抗炎修复的作用，加快紫外光老化皮肤的修复过程，促进皮肤修复。

5、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

6、进一步，上述制备过程还包括：收集培养至融合度为80％以上的细胞培养上清，加酸溶液调整培养上清的ph值至4.5～5.5，然后于4～37℃温育2～48h后离心，最后将离心后的上清液通过0.5～5.0nm的分子筛，制得处理后的间充质干细胞培养上清液。

7、采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明还通过特定的处理方式对间充质干细胞培养上清液进行处理，处理后所得的间充质干细胞培养上清液能够有效促进紫外光损伤细胞的增殖和活力，促进tgf-β的表达与分泌，抑制mmps的表达和分泌，从而有助于紫外光损伤细胞的正常修复，即从多角度来促进组织修复。

8、进一步，所添加的酸为乙酸、柠檬酸、盐酸和磷酸中的至少一种，其浓度为1.5～4mol/l。

9、进一步，酸的浓度为1.5～4mol/l。

10、进一步，加酸溶液调整培养上清的ph值至5。

11、进一步，于37℃温育24h后离心，最后将离心后的上清液通过2.5nm的分子筛。

12、上述制得的间充质干细胞或处理后的间充质干细胞培养上清液在制备修复或抑制皮肤光老化制剂中的应用。

13、进一步地，皮肤光老化是经紫外光损伤后的皮肤。

14、一种修复皮肤光老化的制剂，包括上述制得的间充质干细胞或处理后的间充质干细胞培养上清液。

15、一种抑制皮肤光老化的制剂，包括上述制得的间充质干细胞或处理后的间充质干细胞培养上清液。

16、本发明具有以下有益效果：

17、本发明制备的mscs及其培养上清液可通过组织修复与再生能力和旁分泌生长因子与抗炎因子对紫外损伤后的成纤维细胞和m0巨噬细胞起到抗炎修复的作用，加快紫外光老化皮肤的修复过程，促进皮肤修复。通过增加细胞活力，促进tgf-β的表达与分泌，抑制mmps的表达和分泌，抑制胶原蛋白和弹性蛋白的降解，调控炎性机制表达，降低炎症反应，在促进成纤维细胞组织修复的同时抑制炎症反应，可加快促进皮肤光老化组织修复，可作为从细胞水平治疗皮肤光老化从而抑制衰老过程的一种治疗手段。

技术特征：

1.一种具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括：获取组织，然后分离原代干细胞，对原代干细胞进行贴壁培养至融合度为80％以上后，采用胰蛋白酶消化贴壁细胞，然后用细胞培养基终止后，制得具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：收集培养至融合度为80％以上的细胞培养上清，加酸溶液调整培养上清的ph值至4.5～5.5，然后于4～37℃温育2～48h后离心，最后将离心后的上清液通过0.5～5.0nm的分子筛，制得处理后的间充质干细胞培养上清液。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所添加的酸为乙酸、柠檬酸、盐酸和磷酸中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，酸的浓度为1.5～4mol/l。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，加酸溶液调整培养上清的ph值至5。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，于37℃温育24h后离心，最后将离心后的上清液通过2.5nm的分子筛。

7.采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞或处理后的间充质干细胞培养上清液。

8.权利要求7所述的间充质干细胞或处理后的间充质干细胞培养上清液在制备修复或抑制皮肤光老化制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，皮肤光老化是经紫外光损伤后的皮肤。

10.一种修复或抑制皮肤光老化的制剂，其特征在于，包括权利要求7所述的间充质干细胞或处理后的间充质干细胞培养上清液。

技术总结
本发明公开了一种具有修复皮肤光老化功能的间充质干细胞及其制备方法和应用，制备方法包括：获取组织，然后分离原代干细胞，对原代干细胞进行贴壁培养至融合度为80％以上后，采用胰蛋白酶消化贴壁细胞，然后用细胞培养基终止后，制得间充质干细胞，并将上清液进行加酸和分子筛处理后得到处理后的上清液。本发明制备的间充质干细胞及其处理后的培养上清液可通过组织修复与再生能力和旁分泌生长因子与抗炎因子对紫外损伤后的成纤维细胞和M0巨噬细胞起到抗炎修复的作用，加快紫外光老化皮肤的修复过程，促进皮肤修复。

技术研发人员：王洁
受保护的技术使用者：成都清科生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11