一种木糖醇脱氢酶突变体、编码该突变体的核苷酸及其应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种木糖醇脱氢酶突变体、编码该突变体的核苷酸及其应用。

背景技术：

1、阿拉伯糖醇(d-arabitol)，是一种天然的五碳多元糖醇，其分子式为c5h12o5，分子量152.15。d-阿拉伯糖醇是最具附加值的十二种平台化合物之一，其在食品领域是一种重要的功能性食品添加剂，与蔗糖(4kcal/g)和木糖醇(2.4kcal/g)的热量值相比，d-阿拉伯糖醇的热量值仅为0.2kcal/g。不仅如此，d-阿拉伯糖醇能够抑制致龋细菌生长，入口后吸热溶解，使口腔产生一种清凉的感觉。因此，d-阿拉伯糖醇作为一种抗龋齿多元醇在口腔保健产品中具有很大的应用潜力。同时，d-阿拉伯糖醇可作为合成药物或高附加值化学品的中间物，如木糖醇、丙二醇、抗致病性药物等。所以，d-阿拉伯糖醇所具有的这些特性，使它在食品、医药、化工等众多领域的发展前景十分广阔，备受国内外的重视。

2、d-阿拉伯糖醇的生产方法有自然提取法、化学合成法和生物合成法。在自然界中的地衣类和蘑菇类植物中能够直接提取少量d-阿拉伯糖醇，但自然提取法底物昂贵，提取过程难度较大，在经济和产量上无法满足需求。因此，化学法和生物法是d-阿拉伯糖醇生产的主要研究方向。目前，d-阿拉伯糖醇的工业生产主要使用化学合成法，通过化学加氢还原阿拉伯糖、阿拉伯糖内酯或来苏糖生产d-阿拉伯糖醇。但是，加氢还原的过程需要昂贵的催化剂、较高的能源消耗、严苛的实验条件以及高成本的生产设备，同时化学法生产绕不开环境污染问题，这就使得d-阿拉伯糖醇的生产难以满足各领域的市场需求。因此，需要研究出一种既能满足大规模生产，又能降低经济成本的方法。

3、近年来，研究者们逐渐将目光转向以更加廉价易得的农业副产物秸秆、半纤维素水解物木糖为起始廉价底物，整个代谢途径如下：即从桔杆出发，水解得到木糖，木糖经过木糖还原酶反应后，生成的d-木糖醇再经木糖醇脱氢酶(xdh)催化生成d-木酮糖，生成的d-木酮糖经过阿拉伯糖醇脱氢酶(ardh)催化生成阿拉伯糖醇。目前，生物法生产d-阿拉伯糖醇的研究大多集中在天然酵母以葡萄糖为原料发酵生产d-阿拉伯糖醇，从木糖出发构建基因工程菌生产d-阿拉伯糖醇鲜有研究报道。另一方面，从木糖出发生产d-阿拉伯糖醇代谢途径中，木糖醇脱氢酶(xdh)活性不足，这是从木糖出发生物合成d-阿拉伯糖醇的主要瓶颈。因此，需要开发一种高活性的木糖醇脱氢酶。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种木糖醇脱氢酶突变体、编码该突变体的核苷酸及其应用。在本发明中，利用蛋白质工程及酶工程技术，对一种天然的木糖醇脱氢酶(xdh)进行三级结构预测，理性分析揭示其催化活性中心，通过对活性中心氨基酸残基进行理性设计，获得了一种催化活性显著提升的木糖醇脱氢酶突变体，记为xdh-g161a-s163a，所述木糖醇脱氢酶突变体具有用于d-阿拉伯糖醇生产的潜力。

2、本发明首先提供了一种木糖醇脱氢酶突变体，所述木糖醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no:1所示。

3、本发明还提供了编码所述木糖醇脱氢酶突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seq idno:2所示。

4、本发明还提供了所述木糖醇脱氢酶突变体的构建方法，所述木糖醇脱氢酶突变体在野生型木糖醇脱氢酶(xdh)的基础上，将木糖醇脱氢酶氨基酸序列第161位由ggc编码的甘氨酸突变为由gca编码的丙氨酸，将氨基酸序列第163位由tca编码的丝氨酸突变为由gca编码的丙氨酸，获得突变体命名为g161a-s163a，并通过340nm紫外分光光度计测定该酶转化nad到nadh的酶活力进行酶活力验证。

5、进一步地，所述野生型木糖醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:3所示，编码所述野生型木糖醇脱氢酶的核苷酸序列如seq id no:4所示。

6、本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含上述编码所述木糖醇脱氢酶突变体的核苷酸。

7、本发明中还提供了一种重组菌，所述重组菌包含上述编码所述木糖醇脱氢酶突变体的核苷酸、或上述重组载体、或表达上述木糖醇脱氢酶突变体。

8、进一步地，所述重组菌为大肠杆菌。

9、本发明还提供了上述木糖醇脱氢酶突变体、重组载体或重组菌在与d-阿拉伯糖醇脱氢酶协同生产d-阿拉伯糖醇中的应用。

10、进一步地，所述应用为代谢木糖醇生成d-阿拉伯糖醇。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

12、本发明中，通过同源多序列比对和在线蛋白质信息分析平台、三级结构预测、底物与酶的分子对接、以及活性中心关键催化残基的保守性分析等步骤，利用半理性设计获得了一个酶活力显著提升的木糖醇脱氢酶，其具有更高的催化活性，可用于d-阿拉伯糖醇的生产。

13、本发明通过酶工程和合成生物学设计，对一个天然的木糖醇脱氢酶进行半理性设计，通过理性的结构以及进化分析，获得了一个高活性的非天然酶，其催化活性的提升，有利于促进底盘细胞代谢木糖醇生成d-阿拉伯糖醇，进而提高d-阿拉伯糖醇的产率。

14、本发明中，摒弃了传统的非理性设计思路，通过半理性设计的方式，设计了一个高活性的木糖醇脱氢酶(xdh-g161a-s163a)，相比传统的非理性方式，本发现提供的设计方法具有快速简便的优势，极大的降低的突变体筛选库，对其他脱氢酶的改造具有重要的理论和实践意义，所设计的xdh-g161a-s163a具有可用于高效生产d-阿拉伯糖醇的工业生产的潜力。

技术特征：

1.一种木糖醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述木糖醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.编码所述木糖醇脱氢酶突变体的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列如seq idno:2所示。

3.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求2所述的编码所述木糖醇脱氢酶突变体的核苷酸。

4.一种重组菌，所述重组菌包含权利要求2所述的编码所述木糖醇脱氢酶突变体的核苷酸、或权利要求3所述的重组载体、或表达权利要求1所述的木糖醇脱氢酶突变体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为大肠杆菌。

6.权利要求1所述的木糖醇脱氢酶突变体的构建方法，其特征在于，包括：

7.根据权利要求6所述的木糖醇脱氢酶突变体的构建方法，其特征在于，所述野生型木糖醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:3所示，编码所述野生型木糖醇脱氢酶的核苷酸序列如seq id no:4所示。

8.权利要求1所述的木糖醇脱氢酶突变体、权利要求3所述的重组载体、或权利要求4～5任一项所述的重组菌在与d-阿拉伯糖醇脱氢酶协同生产d-阿拉伯糖醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为代谢木糖醇生成d-阿拉伯糖醇。

技术总结
本发明提供了一种木糖醇脱氢酶突变体、编码该突变体的核苷酸及其应用，属于生物工程技术领域；在本发明中，利用蛋白质工程及酶工程技术，对一种天然的木糖醇脱氢酶(XDH)进行三级结构预测，理性分析揭示其催化活性中心，通过对活性中心氨基酸残基进行理性设计，获得了一种催化活性显著提升的木糖醇脱氢酶突变体，所述木糖醇脱氢酶突变体可用于与D‑阿拉伯糖醇脱氢酶协同生产D‑阿拉伯糖醇。

技术研发人员：齐向辉,黄健,赵梅,张存胜,尤瓦,翟彼得
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13