基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用与流程

本发明属于生物医药分离纯化的，涉及动物有效成分的提取，尤其涉及基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用。

背景技术：

1、水蛭素是从水蛭（leech）唾液腺中分离纯化制得的一种由65-66个氨基酸残基组成的、无糖基化的小分子酸性单链多肽。水蛭素具有高度特异的抗凝血酶活性，可抑制凝血酶结合底物，是迄今为止发现的作用最强的凝血酶特异性抑制剂，可改善血液微循环，发挥良好的抗凝化瘀效果，对人类心脑血管疾病，尤其是脑血栓等血栓性疾病具有显著的功效；此外，水蛭素还具有较强的抗氧化性，可协助机体免疫细胞识别、吞噬、包裹、清除自由基等，防止皮肤因被氧化而产生细纹、色斑、干燥等衰老现象。而与天然水蛭素相比，重组水蛭素在第63位氨基酸(酪氨酸)上未硫酸酪化，活性略低，对凝血酶的抑制作用仅为天然水蛭素的1/10。因此，天然水蛭素在医药、保健品及化妆品研究领域均具有巨大的应用前景。

2、目前天然水蛭素多是以活体水蛭为原料提取得到，如公开号为cn 102286108 a的专利提供一种天然水蛭素的生产方法先从吸血水蛭活体中提取天然水蛭素粗品，然后经过分离纯化得到天然水蛭素粉；公开号为cn 108727487 a的专利提供一种水蛭素的液膜萃取方法，将冷冻水蛭捣碎制得水蛭素粗提液；公开号为cn 102964446 a的专利提供一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法。但是，以活体水蛭为原料提取时方法大多繁杂，耗时久，不利于工业化生产；同时提取得到的水蛭素有效成分活性不高，多在150-6000atu/g左右，杂质含量也较高，不适合注射用药。而公开号为cn 107936115 a的专利提供的水蛭素提取方法，虽然从水蛭粉末中提取水蛭素，操作简单，但所得水蛭素的活性依然较低。因此，开发一种步骤简单且水蛭素产品活性更高的水蛭素提取方法，对水蛭素的进一步研究和应用推广具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、针对背景技术中存在的技术问题，本发明提出基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用，该方法提取得到活性较高的高质量天然水蛭素，且操作简单、成本低，可实现快速工业化生产。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法，包括以下步骤：

4、（1）从蚂蟥粉中粗提水蛭素：按照蚂蟥粉重量的2-6倍加入浸提液，浸泡，超声，离心取上清，将沉淀继续重复提取两次，收集所有上清液并调节ph至4.5，利用不同蛋白在不同ph下溶解度的差异将一部分杂蛋白沉淀去除，再次离心取上清液，调节ph至7.0，为下一步中性条件下水蛭素与磁球的结合做准备。

5、（2）凝血酶亲和磁性微球制备：将凝血酶与羧基磁性微球混合反应，然后加入乙醇胺继续反应，分离去除液体，经洗涤，得凝血酶亲和磁性微球；其中，加入乙醇胺是为了屏蔽磁球表面未完全反应的羧基，防止吸附蚂蟥粗提液中的杂蛋白，造成水蛭素纯度下降。

6、（3）凝血酶亲和磁性微球分离纯化：将步骤（2）的凝血酶亲合磁性微球加入到步骤（1）的水蛭素粗提液中混合均匀后静置，随后磁分离去除上清，再依次进行洗涤和洗脱，收集洗脱液。

7、（4）脱盐浓缩：将步骤（3）的洗脱液透析处理，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h；将透析后的洗脱液通过旋转蒸发(40-70℃，100-130r/min)进行浓缩，去除30-80%的水分后，将浓缩液于-8℃冷藏备用。

8、（5）取步骤（4）的浓缩液利用冻干机进行冻干，得到粉末态的水蛭素，收集并密封保存。

9、优选地，所述步骤（1）中浸提液的用量为蚂蟥粉重量的2-4倍；所述浸提液的成分为50mm tris(三羟甲基氨基甲烷)、10mm edta(乙二胺四乙酸)、150mm氯化钠、3% sds（十二烷基硫酸钠）、2% triton x-100和2% 脱氧胆酸钠。

10、优选地，所述步骤（2）中凝血酶和乙醇胺使用时均预先溶于浓度为50mm/l、ph5.5的mes缓冲液；羧基磁性微球预先用活化剂edc/sulfo-nhs活化；凝血酶与羧基磁性微球在室温下反应2-3h，然后加入乙醇胺继续在室温下反应1-1.5h。

11、更优选地，所述凝血酶的活性为2ku/mg，凝血酶与mes缓冲液的质量体积比为1:(1-5)mg/ml；羧基磁性微球的粒度为2.5-3.0μm；凝血酶与乙醇胺的质量体积比为(4-1):1mg/ml；乙醇胺与mes缓冲液的体积比为1:(5-10)。

12、优选地，所述步骤（3）中洗涤具体为分别用磷酸盐溶液和去离子水洗涤凝血酶亲合磁性微球；磷酸盐溶液的ph为7.4；洗脱使用的洗脱液为(0.01-0.03)mol/l kcl-(0.05-0.2)mol/l hcl。该浓度范围的洗脱液既可维持水蛭素的活性和亲和介质的稳定性，同时又能有效分离洗脱水蛭素。该步骤使用的洗涤液与洗脱液均为纯盐溶液，无毒无污染，分离效率高，可适配于全自动核酸纯化仪，实现自动化生产。

13、优选地，所述步骤（4）中透析具体为使用截留分子量小于等于5000da的透析袋，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h，透析的总时间不少于24h；所述浓缩具体为使水分去除率达到70-80%。

14、本发明还包括上述分离纯化方法得到的水蛭素。

15、优选地，所述水蛭素的活性为17167atu/g。

16、本发明还包括所述水蛭素在制备保健食品、药品或化妆品中的应用。

17、本发明的有益效果：

18、本发明用自制浸提液从蚂蟥粉中粗提水蛭素，然后利用制得凝血酶亲和磁性微球进一步分离纯化，最终得到活性为17000 atu/g以上的天然水蛭素。本发明自制的浸提液能将蚂蟥的细胞壁破坏，使其中的水蛭素充分溶出，可为蚂蟥粉中水蛭素的粗提提供更高的效率。本发明选用羧基磁性微球制备凝血酶亲和磁性微球，可充分利用其样品富集作用，与琼脂糖微球和聚合物微球相比可分离纯化得到活性更高的水蛭素，且最终所得的水蛭素中的杂质大大少于水蛭素粗提液中的杂质，水蛭素纯度得到明显提高。凝血酶亲和磁性微球使用时不要求样品浓度、不使用有机溶剂、载量高、对环境的危害小，手动操作或自动化操作也都很方便。本发明分离纯化水蛭素的方法操作简单、生产成本低，所得水蛭素产品的活性及纯度高、保存期长、质量稳定，可为保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料，有利于工业化生产及应用。

技术特征：

1.基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（1）中浸提液为蚂蟥粉重量的2-6倍；所述浸提液的成分为50mm tris、10mm edta、150mm 氯化钠、3% sds、2% triton x-100和2% 脱氧胆酸钠。

3.根据权利要求2所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于，所述收集上清液并调节ph具体为：收集上清液并调节ph至4.5，再次离心取上清液，调节ph至7.0。

4.根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中凝血酶和乙醇胺使用时均预先溶于浓度为50mm/l、ph5.5的mes缓冲液；羧基磁性微球预先用活化剂edc/sulfo-nhs活化；凝血酶与羧基磁性微球在室温下反应2-3h，然后加入乙醇胺继续在室温下反应1-1.5h。

5.根据权利要求4所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述凝血酶的活性为2ku/mg，凝血酶与mes缓冲液的质量体积比为1:(1-5)mg/ml；羧基磁性微球的粒度为2.5-3.0μm；凝血酶与乙醇胺的质量体积比为(4-1):1mg/ml；乙醇胺与mes缓冲液的体积比为1:(5-10)。

6. 根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）中洗脱使用的洗脱液为含(0.01-0.03)mol/l kcl-(0.05-0.2)mol/l hcl的水溶液。

7.根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（4）中透析具体为使用截留分子量小于等于5000da的透析袋，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h；所述浓缩具体为使水分去除率达到30-80%。

8.权利要求1-7任一项所述的分离纯化方法得到的水蛭素。

9.根据权利要求8所述的水蛭素，其特征在于：所述水蛭素的活性为17167atu/g。

10.权利要求8所述的水蛭素在制备药品、保健食品或化妆品中的应用。

技术总结
本发明属于生物医药分离纯化的技术领域，尤其涉及基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用。本发明用自制浸提液从蚂蟥粉中粗提水蛭素，然后选用羧基磁性微球制备凝血酶亲和磁性微球，利用凝血酶亲和磁性微球进一步分离纯化，最终得到活性为17000ATU/g以上的天然水蛭素。本发明自制的浸提液能将蚂蟥的细胞壁破坏，使其中的水蛭素充分溶出，为蚂蟥粉中水蛭素的粗提提供更高的效率；制备的凝血酶亲和磁性微球可充分利用其样品富集作用，与琼脂糖微球和聚合物微球相比可分离纯化得到活性及纯度更高的水蛭素，保存期长、质量稳定，可为保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料，有利于工业化生产及应用。

技术研发人员：李璐璐,黄明贤,屈琴,周维海
受保护的技术使用者：郑州英诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13