一种二氢叶酸还原酶及其应用

本发明涉及精细化工，尤其涉及了一种二氢叶酸还原酶及其在体外生物合成6-s-四氢叶酸中的应用。

背景技术：

1、l-5-甲基四氢叶酸(l-5-mthf)是一种新型的叶酸类药物，现已逐渐的将其应用到药物以及食品当中。l-5-mthf目前已经成为国际市场上一种新型的维生素保健产品。它能够作为食品添加剂和一些营养保健品的主要成分，不产生任何副作用，同时还具有很好的疗效和功能。

2、叶酸在人体的血液和组织中主要以l-5-mthf的方式存在，参与人体当中的很多生化反应。l-5-mthf是叶酸在体内发挥作用的主要形式，不需要经过复杂的酶促反应，就可以直接被人体吸收和利用。叶酸主要由小肠上端吸收，由叶酸代谢生成l-5-mthf。叶酸又分为单谷氨酸型叶酸和多谷氨酸型叶酸，前者不需要代谢就可以被小肠直接吸收利用，而后者则需要先经过小肠上皮细胞分泌的羧肽酶对其进行分解后才能够被小肠所吸收利用。叶酸被小肠吸收后，在辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadph)以及二氢叶酸还原酶的共同作用下还原得到二氢叶酸，二氢叶酸再被还原型辅酶ⅱ和抗坏血酸还原，代谢生成具有生物活性的thf，最后thf在肝脏当中发生甲基化，生成甲基四氢叶酸最终被人体利用。生化途径的生物活性叶酸涉及一系列酶促反应和辅助因子。吸收的叶酸在肠黏膜细胞代谢过程中减少并甲基化为5-mthf。甲基供体参与了多项生化过程。它还可以作为供体参与核苷酸的合成，支持dna的生物合成。

3、关于l-5-mthf的报道有很多，但由于它本身具有稳定性差，对氧敏感等缺陷，因此在生产上未得到普遍工业化。叶酸的价格相对较低，以其为原料生产l-5-mthf将会有广阔的前景，而其中6-s-四氢叶酸作为生产过程中最重要中间体的合成方法则成为重中之重。

4、6-s-甲基四氢叶酸现有的工艺路线是以叶酸为原料，经还原、拆分等步骤合成而得。化学合成l-5-甲基四氢叶酸钙的方法都存在拆分难，收率低，污染大，产业化困难等诸多问题，因此寻找一条化学合成之外的方法就成为非常有现实意义的探索。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供一种用于体外合成6-s-四氢叶酸的二氢叶酸还原酶；本发明的第二目的是提供上述二氢叶酸还原酶编码的基因或核酸；本发明的第三目的是提供上述二氢叶酸还原酶在体外生物合成6-s-四氢叶酸中的应用；本发明的第四目的是提供一种用上述二氢叶酸还原酶体外生物合成6-s-四氢叶酸的方法。

2、技术方案：本发明所述的二氢叶酸还原酶的氨基酸序列选自seq id no.1、seqidno.2、seq id no.3或seq id no.4。

3、氨基酸序列为seq id no.1的二氢叶酸还原酶命名为dhfr-1，氨基酸序列为seqid no.2的二氢叶酸还原酶命名为dhfr-2，氨基酸序列为seq id no.3的二氢叶酸还原酶命名为dhfr-3，氨基酸序列为seq id no.4的二氢叶酸还原酶命名为dhfr-4。

4、本发明所述的编码上述二氢叶酸还原酶的基因或核酸。

5、进一步地，所述二氢叶酸还原酶的基因或核酸的核苷酸序列选自seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8。

6、本发明所述的二氢叶酸还原酶、编码其的基因或核酸在体外生物合成6-s-四氢叶酸中的应用。

7、本发明所述的一种6-s-四氢叶酸体外生物合成方法，包括以下步骤：

8、构建含有上述的二氢叶酸还原酶的基因的重组载体，并将重组载体转入大肠杆菌内，培养得到重组大肠杆菌菌液；将重组大肠杆菌菌液裂解，得到二氢叶酸还原酶液；将叶酸、氢氧化钠水溶液和还原剂混合得到二氢叶酸；将二氢叶酸、二氢叶酸还原酶液和辅酶因子混合进行酶促反应，反应结束即得6-s-四氢叶酸。

9、进一步地，步骤(2)中所述大肠杆菌菌液裂解条件为20000-35000g/min，离心时间为30-60min。

10、进一步地，还包括二氢叶酸还原酶液的纯化处理，或/和固定化酶处理。

11、进一步地，纯化处理步骤包括：将重组大肠杆菌菌液裂解后得到的粗酶液流经ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的ni柱洗脱液流经q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为kcl)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行透析，得纯化酶溶液。

12、进一步地，制作固定化酶的过程中固定化载体可选择但不限于氨基树脂和环氧树脂；反应体系的ph值为4-9反应时间为1-6h。

13、进一步地，所述还原剂为锌粉或连二亚硫酸钠。

14、进一步地，所述辅酶因子为nadh或nadph，酶促反应的温度为20-45℃，酶促反应的ph值为5-9，酶促反应时间为1-24h。

15、进一步地，所述辅酶因子与二氢叶酸的质量比为0.1-3：1，所述二氢叶酸还原酶液与二氢叶酸的质量比为0.002-0.01：1。

16、进一步地，所述酶促反应中还包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，葡萄糖、二氢叶酸和辅酶因子的质量比为0.4-1：1：0.01-1，，葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的质量比为0.001-0.01：1。

17、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明公开了一种二氢叶酸还原酶，其用于体外生物合成6-s-四氢叶酸极大降低了生产成本，消除了副产物处理过程中产生的环境影响。且操作简单，条件温和，耗时较短，转化率和产物纯度均在86％以上，适合产业化应用。

技术特征：

1.一种二氢叶酸还原酶，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列选自seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4。

2.一种编码权利要求1所述的二氢叶酸还原酶的基因或核酸。

3.根据权利要求2所述的二氢叶酸还原酶的基因或核酸，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶的基因或核酸的核苷酸序列选自seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7或seq idno.8。

4.一种权利要求1所述的二氢叶酸还原酶、权利要求2或3所述的基因或核酸在体外生物合成6-s-四氢叶酸中的应用。

5.一种6-s-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：构建含有权利要求2或3所述的二氢叶酸还原酶的基因的重组载体，并将重组载体转入大肠杆菌内，培养得到重组大肠杆菌菌液；将重组大肠杆菌菌液裂解，得到二氢叶酸还原酶液；将叶酸、氢氧化钠水溶液和还原剂混合得到二氢叶酸；将二氢叶酸、二氢叶酸还原酶液和辅酶因子混合进行酶促反应，反应结束即得6-s-四氢叶酸。

6.根据权利要求5所述的6-s-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，还包括二氢叶酸还原酶液的纯化处理，或/和固定化酶处理。

7.根据权利要求5所述的6-s-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，所述还原剂为锌粉或连二亚硫酸钠。

8.根据权利要求5所述的6-s-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，所述辅酶因子为nadh或nadph，酶促反应的温度为20-45℃，酶促反应的ph值为5-9，酶促反应时间为1-24h。

9.根据权利要求5所述的6-s-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，所述辅酶因子与二氢叶酸的质量比为0.1-3：1，所述二氢叶酸还原酶液与二氢叶酸的质量比为0.002-0.01：1。

10.根据权利要求5所述的6-s-四氢叶酸体外生物合成方法，其特征在于，所述酶促反应中还包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，葡萄糖、二氢叶酸和辅酶因子的质量比为0.4-1：1：0.01-1，葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的质量比为0.001-0.01：1。

技术总结
本发明公开了一种二氢叶酸还原酶及其应用，所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。所述二氢叶酸还原酶用于体外生物合成6‑S‑四氢叶酸极大降低了生产成本，消除了副产物处理过程中产生的环境影响。且操作简单，条件温和，耗时较短，转化率和产物纯度均在86%以上，适合产业化应用。

技术研发人员：张坤晓,王兆俊,侯学雯,李梦磊,叶蕾
受保护的技术使用者：江苏海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13