一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置与流程

本发明涉及核酸片段提取试剂，尤其涉及一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置。

背景技术：

1、核酸是脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作，现有的一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置在使用过程中主要存在如下问题。

2、在裂解过程中，裂解时间的长短，直接影响到所提取或纯化核酸的浓度，裂解时间太短，核酸不能充分裂解，所提取或纯化的核酸浓度将较低，裂解时间太长，所提取或纯化的核酸会被降解。

3、在核酸裂解后的提取或纯化过程中，通过磁珠的特异性吸附来富集体系中的核酸，磁珠量过少，不能有效的将体系中的核酸吸附出来，核酸量将会减少。磁珠量过多，非特异性吸附会增多，纯度会变差。

4、在核酸提取或纯化过程中，需要通过漂洗板将样品中的蛋白和盐离子去除，才能提高所提取或纯化核酸的纯度，漂洗次数太少，由于不能有效将蛋白和盐离子去除，所提取或纯化的核酸的纯度太低，漂洗次数太多，所提取或纯化的核酸纯度虽有提高，但是在漂洗过程中由于核酸损失，所提取或纯化核酸的浓度将会降低。

5、样本量的多少会影响所提取或纯化核酸的浓度和纯度，样本量太低，所提取或纯化的核酸浓度较低，不利于后续的检验，样本量太高，细胞不能充分裂解，且样本中的杂质不能有效被去除，导致所提取或纯化核酸的纯度降低。

技术实现思路

1、本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置。

2、本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

3、一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，它包括以下步骤：

4、步骤1：调制样本板蛋白酶k，用蛋白酶k、甘油及适量超纯水配置成含有20mg/ml、50％甘油的溶液，用hcl或naoh调节ph至7.5，贴上标签，写上名称、批号、配制人和失效期，室温储存；

5、步骤2：调制样本板，用盐酸胍及适量超纯水配置成含有4.5m盐酸胍的水溶液，并用hcl或naoh调节ph至6.5，贴上标签，写上名称、批号、配制人和失效期，室温储存；

6、步骤3：调制漂洗板一，用乙二胺四乙酸二钠盐、三羟甲基氨基甲烷、乙醇及适量超纯水配置成含有1mm乙二胺四乙酸二钠盐、10mm tris base、75％乙醇的水溶液，用hcl或naoh调节ph至7.5，贴上标签，写上名称、批号、配制人和失效期，室温储存；

7、步骤4：调制漂洗板二，用乙二胺四乙酸二钠盐、三羟甲基氨基甲烷、磁珠、乙醇及适量超纯水配置成含有1mm乙二胺四乙酸二钠盐、10mm tris base、75％乙醇、100mg/ml磁珠的水溶液，用hcl或naoh调节ph至7.5，贴上标签，写上名称、批号、配制人和失效期，室温储存；

8、步骤5：调制洗脱板为ph7.0的depc处理水；

9、步骤6：然后将蛋白酶k、样本板、漂洗板一、漂洗板二和洗脱板以一定的比例分装至磁棒套内；

10、步骤7：然后工作人员取200μl的样品放置在样品管内；

11、步骤8：将样品投放至在分装液内，并在室温下静置裂解6min；

12、步骤9：在核酸裂解后的提取或纯化过程中，通过磁珠的特异性吸附来富集体系中的核酸，工作人员需要在裂解完成后的溶液中加入2mg/人份的磁珠，核酸可与磁珠表面的羟基发生特异性裂解，利用磁棒吸附、转移和释放磁珠，自动完成核酸的提取和纯化；

13、步骤10：在核酸提取或纯化过程中，需要通过漂洗板将样品中的蛋白和盐离子去除，才能提高所提取或纯化核酸的纯度，工作人员需要通过进行两次漂洗来提高所提取或纯化核酸的纯度；

14、步骤11：在计算核酸纯度时，工作人员需要取3份不同全血样本200μl，分别编号为c1、c2、c3，取待检测试剂，按照说明书提取或纯化c1、c2、c3样本中的核酸，用od2000c紫外、可见分光光度仪检测其提取或纯化的核酸纯度(a260/a280值)；

15、步骤12：在计算核酸浓度时，工作人员需要取1份全血样本，平均分成3等份，每份200μl，分别编号为n1、n2、n3，取待检测试剂，按照说明书提取或纯化n1、n2、n3样本中的核酸，用od2000c紫外、可见分光光度仪检测其提取或纯化的核酸浓度，根据公式计算浓度平均值，结果提取或纯化后核酸的浓度应≥10ng/μl；

16、步骤13：在计算核酸精密度时，工作人员需要取1份全血样本，混匀后，平均分成10份，每份200μl，取待检测试剂，按照说明书分别提取或纯化其中核酸，用od2000c微量分光光度仪分别测各样本所提取或纯化核酸浓度，根据公式计算变异系数cv，结果提取或纯化后的浓度值的cv应≤15％。

17、进一步的，所述步骤1中蛋白酶k为无色透明液体或白色粉末，活性≥20u/mg。

18、进一步的，所述步骤2样本板中的盐酸胍为白色或微黄色块状物，且6m盐酸胍水溶液的ph值在6.4±0.2之间。

19、进一步的，所述步骤3中乙二胺四乙酸二钠盐为白色晶体状粉末，纯度＞98％。

20、进一步的，所述步骤4中tris base为白色结晶或粉末，纯度＞98％。

21、进一步的，所述步骤5中depc处理水为无色透明液体，且溶解在depc处理水中的核酸2-8℃放置3天，浓度下降在10％以内。

22、进一步的，所述步骤6中蛋白酶k、样本板、漂洗板一、漂洗板二和洗脱板的分装比列为：2ml/支、600μl/孔、500μl/孔、500μl/孔、100μl/孔。

23、本发明的有益效果在于：

24、1、本发明通过改变蛋白酶k的裂解时间来选择最佳的裂解时间，本实验分为3组，在其他条件相同情况下分别在加入蛋白酶k混匀后室温下静置裂解3min、6min、9min裂解，每组3个平行，取其平均值，比较蛋白酶k的不同裂解时间对所提取或纯化核酸的浓度和纯度的影响。

25、2、本发明通过在其他条件相同的情况下，改变核酸提取或纯化过程中的磁珠浓度，分别加入2mg/人份、4mg/人份、8mg/人份的磁珠进行提取或纯化，每组3个平行，取其平均值，比较不同磁珠量对所提取或纯化核酸的量的影响。

26、3、本发明通过在其他条件相同的情况下，分别用漂洗板漂洗1次、2次、3次，比较不同漂洗次数对所提取或纯化的核酸的浓度和纯度的影响。

27、4、本发明通过在其他条件相同的情况下，分别取50μl、100μl、150μl、200μl、400μl样本提取或纯化核酸，比较不同样本量对提取或纯化的核酸的浓度和纯度的影响。

技术特征：

1.一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，它包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，其特征在于：所述步骤1中蛋白酶k为无色透明液体或白色粉末，活性≥20u/mg。

3.根据权利要求1所述的一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，其特征在于：所述步骤2样本板中的盐酸胍为白色或微黄色块状物，且6m盐酸胍水溶液的ph值在6.4±0.2之间。

4.根据权利要求1所述的一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，其特征在于：所述步骤3中乙二胺四乙酸二钠盐为白色晶体状粉末，纯度＞98％。

5.根据权利要求1所述的一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，其特征在于：所述步骤4中tris base为白色结晶或粉末，纯度＞98％。

6.根据权利要求1所述的一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，其特征在于：所述步骤5中depc处理水为无色透明液体，且溶解在depc处理水中的核酸2-8℃放置3天，浓度下降在10％以内。

7.根据权利要求1所述的一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，其特征在于：所述步骤6中蛋白酶k、样本板、漂洗板一、漂洗板二和洗脱板的分装比列为：2ml/支、600μl/孔、500μl/孔、500μl/孔、100μl/孔。

技术总结
本发明公开了一种核酸片段提取试剂的制备方法及纯化装置，它包括以下步骤；步骤1：调制样本板蛋白酶K，用蛋白酶K、甘油及适量超纯水配置成含有20mg/ml、50％甘油的溶液，用HCl或NaOH调节PH至7.5，贴上标签，写上名称、批号、配制人和失效期，室温储存。有益效果在于：本发明通过改变蛋白酶K的裂解时间来选择最佳的裂解时间，本实验分为3组，在其他条件相同情况下分别在加入蛋白酶K混匀后室温下静置裂解3min、6min、9min裂解，每组3个平行，取其平均值，比较蛋白酶K的不同裂解时间对所提取或纯化核酸的浓度和纯度的影响。

技术研发人员：柳文军,赵凤梅,赵伟奇,谭祈洪
受保护的技术使用者：江苏一叶兰生物医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13