一种靶向基因启动子G-四联体区域的sgRNA及其用途

本发明属于生物，具体涉及基因编辑，尤其涉及一种靶向基因启动子g-四联体区域的sgrna组合及其应用。

背景技术：

1、g-四联体(g4)是由富含鸟嘌呤(g)的核酸序列形成的四链结构，构成单元是g-四分体，由四个鸟嘌呤形成环状排列，彼此之间由hoogsten氢键稳定。在na+和k+的驱动下，平面g-四分体结构互相堆叠在彼此的顶部，形成四股螺旋结构。g-四联体的拓扑结构非常多态，可以由富含g的dna链在分子内或分子间折叠产生。分子内折叠需要一条dna链中存在四个或更多的g，而分子间折叠可以由两条或四条dna链产生，根据dna链的方向产生平行或反平行结构。

2、稳定的结构对于g-四联体与配体即转录因子的结合非常重要，同时g-四联体结构在dna中的位置并不是随机的，它与基因组中的功能区域高度共定位，目前越来越多的证据证明g-四联体在生物学中发挥着多种重要作用，调控了一些关键的生物过程、多种人类遗传疾病和癌症的发生与发展。有研究表明大约90％的人类dna复制起点包含g4基序，并且在启动子附近更密集。有研究显示通过突变破坏启动子g4稳定性会增加几个有效致癌基因中的基因表达。相反的，基因表达可以通过g4的稳定配体来抑制。例如gga序列重复存在于原癌基因c-myb的启动子区域，它编码调控造血祖细胞增殖、分化和存活的关键转录因子。1有研究指出在大约3000个人类基因中，g4序列存在于指定编码mrna的5'-utr的区域中，并且调控mrna的翻译。对于与rna g4序列相互作用的配体，可以观察到与dna类似的翻译抑制效应。mrna中的g-四联体稳定性已被证明可以调节人类雌激素受体α的蛋白水解。此外，端粒dna的富含g的长rna转录物terra也富含g4序列。g-四联体还与神经退行性疾病的发展有关，例如肌萎缩侧索硬化症(als)。

3、g4序列存在于许多真核细胞的基因组中，dna g4序列广泛存在于许多重要癌基因的启动子区，是参与癌基因调控的关键因素，更是近年来新发展的抗癌药物重要靶点。研究人员发现在癌细胞中能检测到更多的g4序列，提示g4序列与癌基因的关联性，并首次在乳腺癌细胞中发现g4序列，提示g4序列可作为对抗乳腺癌的重要潜在靶点。中科院张钠课题组发现特异识别g4序列的探针具有潜在抗癌前景。目前许多能够与dna g4序列相结合的小分子已成为公认的抗肿瘤药物，称之为g4 binders，比如cx-3543(nct00780663)、cx-5461(nct02719977)和as1411(nct00740441)现已进入临床试验阶段。综上，研究g4的序列、结构和功能将会极大的增加我们对基因组的空间结构、组织和调控的理解，研究g4与癌基因的关系更是基础生物学的一个热点新领域，将为未来癌症等疾病的诊断和治疗提供新思路、新靶点。

技术实现思路

1、本发明利用碱基编辑工具结合相应位点的sgrna，对g-四联体区域转录因子结合位点进行点突变，破坏g-四连体结构的形成，阻碍相关转录因子与g-四联体的结合，调控相关目的基因的表达，为研究g4结构提供新的方法。

2、本发明首先提供了一种靶向基因启动子g-四联体区域的sgrna，所述sgrna由针对所述基因启动子g-四联体区域的正向、反向dna寡核苷酸序列退火获得。

3、在根据本发明的一个实施方案中，所述基因启动子g-四联体区域选自靶向vegf基因、c-kit基因或c-myc基因的基因启动子g-四联体区域。

4、在根据本发明的一个实施方案中，所述正向反向dna寡核苷酸序列对选自seq idno:1和seq id no:2；seq id no:4和seq id no:5；seq id no:7和seq id no:8；seq idno:10和seq id no:11。

5、在根据本发明的一个实施方案中，sgrna序列分别为seq id no:3、seq idno:6、seq id no:9和seq id no:12。

6、本发明还提供了一种包含上述sgrna的重组载体。

7、本发明进一步提供了一种靶向基因g-四联体的碱基编辑系统，其包含上述的sgrna或权利要求5所述的重组载体，cas9蛋白或其突变体和胞嘧啶脱氨酶。

8、在根据本发明的一个实施方案中，所述胞嘧啶脱氨酶为apobec或aid。

9、在根据本发明的一个实施方案中，所述胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶糖基化酶抑制物ugi连接形成apobec-ugi或aid-ugi；

10、优选地，所述的胞嘧啶脱氨酶apobec或aid和尿嘧啶糖基化酶抑制物ugi以及防止多聚化的热稳定性结构域gb1连接构成apobec-ugi-gb1或aid-ugi-gb1载体。

11、优选地，所述的胞嘧啶脱氨酶apobec或aid和尿嘧啶糖基化酶抑制物ugi以及防止多聚化的热稳定性结构域gb1连于单链抗体scfv构成scfv-apobec-ugi-gb1或scfv-aid-ugi-gb1载体。

12、本发明还提供了上述的sgrna、权利要求5所述的重组载体或上述的碱基编辑系统在使靶基因启动子g-四联体区域点突变中的应用；优选地，所述靶基因选自vegf基因、c-kit基因和c-myc基因中的任一种。

13、本发明进一步提供了一种重组细胞的构建方法，其包括：

14、将上述的sgrna、权利要求5所述的重组载体或碱基编辑系统导入靶细胞的细胞核内，得到重组细胞。

15、本发明的上述技术方案的有益效果如下：

16、本发明提供的通过碱基编辑研究g-四联体的方法，可用于原位定点突变g-四联体序列，调控目的基因表达。

技术特征：

1.一种靶向基因启动子g-四联体区域的sgrna，其特征在于，所述sgrna由针对所述基因启动子g-四联体区域的正向、反向dna寡核苷酸序列退火获得。

2.如权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述基因启动子g-四联体区域选自靶向vegf基因、c-kit基因或c-myc基因的基因启动子g-四联体区域。

3.如权利要求1或2所述的sgrna，其特征在于，所述正向、反向dna寡核苷酸序列分别为seq id no:1和seq id no:2；seq id no:4和seq id no:5；seq id no:7和seq id no:8；seq id no:10和seq id no:11。

4.如权利要求1-3中任一项所述的sgrna，其特征在于，sgrna序列分别为：seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9和seq id no:12。

5.一种包含权利要求1-4中任一项所述sgrna的重组载体。

6.一种靶向基因g-四联体的碱基编辑系统，其特征在于，包含：如权利要求1-4中任一项所述的sgrna或权利要求5所述的重组载体，cas9蛋白或其突变体和胞嘧啶脱氨酶。

7.如权利要求6所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶为apobec或aid。

8.如权利要求6所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶糖基化酶抑制物ugi连接形成apobec-ugi或aid-ugi；

9.如权利要求1-4中任一项所述的sgrna、权利要求5所述的重组载体或权利要求6-8中任一项所述的碱基编辑系统在使靶基因启动子g-四联体区域点突变中的应用；优选地，所述靶基因选自vegf基因、c-kit基因和c-myc基因中的任一种。

10.一种重组细胞的构建方法，其特征在于，包括：

技术总结
本发明提供了一种靶向基因启动子G‑四联体区域的sgRNA及其用途，所述sgRNA针对所述基因启动子G‑四联体区域。本发明利用碱基编辑工具结合相应位点的sgRNA，对靶基因G‑四联体区域转录因子结合位点进行点突变，破坏G‑四连体结构的形成，阻碍相关转录因子与G‑四联体的结合，调控相关目的基因的表达。

技术研发人员：张淑珍,江雯
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13