一株兔源丁酸梭菌CW3及其分离筛选方法和应用

本发明涉及兽医微生物，尤其涉及一株兔源丁酸梭菌cw3及其分离筛选方法和应用。

背景技术：

1、2020年起，抗生素被禁止用于饲料添加使用。而在众多的替抗产品中，微生态制剂因其安全性和有效性而备受关注。家兔产业在我国近年来发展迅速，断奶仔兔腹泻一直是养兔业中的一个难题，而目前市场上的众多益生菌类多来源于人猪鸡，很少有直接来源于兔的，再加上兔肠道的特殊性，因此微生态制剂在兔业中的发展受到限制。因此，寻找安全、抗菌性强、抑菌谱广的益生菌是改善仔兔腹泻的一个重要方向。

2、丁酸梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性梭状芽孢杆菌，主要存在于人和动物的消化道、土壤以及窖泥中。丁酸梭菌能够产生多种营养物质和短链脂肪酸等，能够维持肠道菌群平衡、增强肠道免疫。此外，相比于乳酸菌和双歧杆菌等常见益生菌来说，丁酸梭菌可产生内生孢子，对外界环境和动物消化道环境具有较强的耐受性，因此，被认为是优质的益生菌。丁酸梭菌作为饲料添加剂，可促进动物生长发育，提升动物生产性能，增强机体免疫功能，对沙门氏菌和产气荚膜梭菌等多种致病菌引起的感染具有较强的保护作用。

3、丁酸梭菌在动物肠道内产生的乙酸、丁酸等短链脂肪酸能够被肠道细胞直接利用，是肠道动力的直接来源。丁酸梭菌分泌的有机酸可以使肠腔ph值下降，抑制病原微生物的繁殖，减少肠道毒素，降低腹泻发生率。丁酸梭菌能够促进双歧杆菌和乳杆菌等肠道益生菌的增殖，抑制大肠杆菌和产气荚膜梭菌等致病菌的生长，对畜禽肠道屏障功能具有良好的修复和增强效果，可以作为饲用微生态制剂，在畜禽养殖业中具有良好的应用潜力。目前丁酸梭菌的报道多分离自人、鸡和猪的肠道，但来源于家兔肠道的分离还较少。家兔属于单胃食草性动物，盲肠发达。由于家兔特殊的盲肠结构及“食粪性”的特点，其肠道内的微生物必演化出自己独特的代谢途径，其肠道微生物也会别于其他来源的微生物。

技术实现思路

1、本发明提供了一株兔源丁酸梭菌cw3及其分离筛选方法和应用，该兔源丁酸梭菌cw3经鉴定为丁酸梭菌(clostridium butyricum)，具有较强的产丁酸和抑菌性能，并具有良好的安全性和耐受性，能够降低断奶仔兔的死亡率、预防仔兔腹泻并保护动物肠道健康，在兔业养殖中具有广阔的前景，解决了现有技术中存在的问题。

2、为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案之一是：

3、一株兔源丁酸梭菌cw3，分类命名为：丁酸梭菌(clostridium butyricum)cw3，已于2023年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.26406，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路一号院三号中国科学院微生物研究所。

4、本发明采用的技术方案之二是：

5、一株兔源丁酸梭菌cw3的分离筛选方法，包括如下步骤：

6、(1)兔源丁酸梭菌的分离纯化：

7、将采集的肉兔粪便样品加入生理盐水中，摇床过夜，收集悬液，水浴处理后，用rcm培养基(强化梭菌培养基)从样品中分离出耐热菌株，通过平板划线法纯化菌株；对纯化后菌株进行革兰氏染色实验，选取革兰氏染色为阳性的菌株；

8、(2)兔源丁酸梭菌的鉴定：将分离纯化的菌落分别加入生化鉴定管中反应，选择生化鉴定结果符合《伯杰细胞鉴定手册》中对丁酸梭菌的描述的菌株；进行了微生物质谱鉴定及16srrna鉴定，选择结果显示为丁酸梭菌的菌落；

9、(3)兔源丁酸梭菌的筛选：

10、将经步骤(2)鉴定的完全纯化的菌株接种到液体rcm培养基中，静置培养得到菌株发酵液，发酵液离心后保留上清液，用牛津杯法和吸光度法进行抑菌实验，并进行产酸能力检测，筛选出对肠产毒性大肠埃希氏菌抑菌作用显著且产酸量高的丁酸梭菌菌株cw3。

11、筛选中进行的细菌生长性能、产酸能力及抑菌效果筛选操作如下：

12、a.采用多波长酶标仪检测细菌浊度的方法进行筛选细菌的生长性能记录；

13、b.对菌株离心收集的细菌培养上清液进行高效液相色谱法检测产酸能力；

14、c.将筛选的菌株与肠产毒性大肠埃希氏菌混合培养于厌氧培养液中，吸合适浓度的菌液涂布于伊红美蓝琼脂，计数菌落。

15、d.为了验证上清液的抑菌活性，将筛选的丁酸梭菌的无细胞上清液(cfs)加入肠产毒性大肠埃希氏菌于96孔板中，再分别加入分离菌株、质控菌株的cfs，加入pbs作为阴性对照，并用lb肉汤作为空白对照孔，37℃培养，24h后再在630nm(a630)的参考波长下测量吸光度，进而计算抑菌率。

16、e.对经过a-d的筛选的丁酸梭菌进行了安全性评估，都不含梭菌毒素基因(cpa、cpb、etx、itx、cpe、net b)和肉毒毒素基因(type a、type b、type e、type f)。

17、通过a-e步骤的层层筛选，最后筛出生长性能、产丁酸能力、抑肠产毒性大肠埃希氏菌的效果最优且安全的来自兔源的丁酸梭菌cw3。

18、进一步地，步骤(1)平板划线法为平板稀释法，将稀释后的样品菌悬液涂布培养，选取强化梭菌培养基平板单菌落进行四区划线。

19、本发明采用的技术方案之三是提供了兔源丁酸梭菌cw3的应用。

20、进一步地，提供了兔源丁酸梭菌cw3在抑制肠产毒性大肠埃希氏菌中的应用。

21、进一步地，提供了兔源丁酸梭菌cw3在制备兔用益生菌制品中的应用。

22、进一步地，提供了兔用益生菌制品为断奶仔兔用益生菌制品。

23、本发明的有益效果：

24、本发明从家兔肠道中分离筛选的丁酸梭菌(clostridium butyricum)cw3具有较强的产酸能力和抑菌特性，具有较好的稳定性和安全性。此外，丁酸梭菌cw3在降低仔兔死亡率、预防仔兔腹泻和保护动物肠道健康等方面具有显著的效果，相比现有丁酸梭菌及抗生素用于家兔养殖，更具优势，其在家兔的养殖生产中具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种兔源丁酸梭菌cw3，已于2023年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.26406。

2.如权利要求1所述的兔源丁酸梭菌cw3的分离筛选方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

3.如权利要求1所述的兔源丁酸梭菌cw3在抑制肠产毒性大肠埃希氏菌中的应用。

4.如权利要求1所述的兔源丁酸梭菌cw3在制备兔用益生菌制品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述兔用益生菌制品为断奶仔兔用益生菌制品。

技术总结
本发明涉及兽医微生物技术领域,尤其涉及一种兔源丁酸梭菌CW3及其分离筛选方法和应用。该兔源丁酸梭菌CW3(保藏编号：CGMCC No.26406，保藏日期：2023年1月6日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)具有较强的产丁酸和抑菌性能，并具有良好的安全性和耐受性，能够降低断奶仔兔的死亡率、预防仔兔腹泻并保护动物肠道健康，在兔业养殖中具有广阔的前景。

技术研发人员：刘磊,王春阳,陈文洁,李福昌
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14