一种GDNF新型变体及其应用的制作方法

本发明涉及医药领域，特别是治疗性蛋白的领域。具体地，本发明涉及人胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)的新型变体。gdnf的新型变体可用于帕金森病的治疗。

背景技术：

1、gdnf是公知的神经营养因子，据报道，其在体外和体内向多巴胺能神经元提供营养支持。此外，已报道，gdnf在帕金森病的啮齿动物和灵长类动物模型中提供功能性改善并具有神经保护和修复作用。已将来自大肠杆菌的野生型gdnf蛋白经中枢给药至患有帕金森病的患者，并获得了一定的治疗效果。

2、然而，据报道，gdnf的长期持续过度表达会引起机体的代偿作用，从而导致一系列问题，包括异常出芽、酪氨酸羟化酶下调和体重减轻等。因此，临床上有必要通过调整gdnf的剂量和活性以实现更好的临床结果。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种新的人gdnf变体，其与野生型gdnf相比具有相似的神经保护和修复功能，但在长期施用后不太容易引发机体的代偿作用，因而更适合进行长期给药。

2、因此，在一个方面，本发明提供了一种人gdnf变体，其中所述人gdnf变体的氨基酸序列相较于成熟人野生型gdnf的氨基酸序列包含以下氨基酸突变：l48a、i82v、k96p、a100p、l111a和h126r。

3、更具体地，所述人gdnf变体包含seq id no：2的氨基酸序列。编码所述人gdnf变体的核苷酸序列如seq id no：1所示。

4、更具体地，所述成熟人野生型gdnf包含seq id no：4的氨基酸序列。编码所述成熟人野生型gdnf的核苷酸序列如seq id no：3所示。

5、如本文所用，氨基酸突变l48a是指以成熟人野生型gdnf的氨基酸序列seq id no：4为参考，位置48处的亮氨酸(l)被替换为丙氨酸(a)。此定义同样适用于氨基酸突变i82v、k96p、a100p、l111a和h126r。

6、更具体地，所述人gdnf变体能够与gfrα1受体结合。

7、更具体地，所述人gdnf变体能够诱导ret磷酸化。

8、更具体地，所述人gdnf变体与成熟人野生型gdnf相比更慢地且以更低的水平刺激ret信号传导。

9、更具体地，所述人gdnf变体与成熟人野生型gdnf相比更慢地且以更低的水平刺激ret下游的mapk途径信号传导。

10、更具体地，所述人gdnf变体与野生型gdnf相比具有相似的神经保护和修复功能。

11、更具体地，所述人gdnf变体与野生型gdnf相比，在长期施用后引发较低的代偿作用。

12、如本文所用，长期施用是指gdnf的长期连续施用。长期施用可以指至少1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、一年或更久的施用。优选地，长期施用可以指至少3个月的施用。

13、在另一个方面，本发明提供了一种多核苷酸，其包含编码本发明的人gdnf变体的核苷酸序列。编码本发明的人gdnf变体的核苷酸序列如seq id no：1所示。

14、在另一个方面，本发明提供了一种病毒载体，其包含与如上文所述的多核苷酸。

15、更具体地，所述病毒载体选自重组痘苗病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺相关病毒、重组杆状病毒、重组乳头瘤病毒、重组慢病毒或重组禽痘病毒。

16、在另一个方面，本发明提供了一种细胞，其包含如上文所述的多核苷酸或如上文所述的病毒载体。

17、在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上文所述的人gdnf变体、多核苷酸、细胞，以及一种或多种药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

18、更具体地，所述药物组合物用于长期给药以治疗帕金森病。

19、更具体地，所述药物组合物在长期给药后基本上不引起机体的代偿作用。

20、更具体地，长期给药可以指至少1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、一年或更久的给药。优选地，长期给药可以指至少3个月的给药。

21、更具体地，所述药物组合物在长期给药后与成熟人野生型gdnf的长期给药相比引起较低的代偿作用。

22、更具体地，代偿作用可以包括例如多巴胺(da)和/或酪氨酸羟化酶(th)的表达和/或活性的下调。

23、在另一个方面，本发明提供了如上文所述的人gdnf变体、多核苷酸、病毒、细胞或药物组合物在制备用于长期给药以治疗帕金森病的药物中的用途。

24、本发明的有益效果

25、据报道，长期未受控制和持续的gdnf过表达会导致代偿性变化(georgievska等人，2002b；barroso-chinea等人，2016)，可能超过营养作用。在临床前模型中，gdnf长期连续给药后出现代偿作用，包括降低da生物合成途径酶的表达、降低th的转录和活性(georgievska等人，2002a；chtarto等人，2007)以及dat活性(barroso-chinea等人，2016)。这些神经化学效应可能干扰神经营养作用，并可能降低临床获益。

26、本发明人通过大量的实验，惊讶地发现一种新的人gdnf变体，其通过几个特定氨基酸的突变，在不改变gdnf与其受体结合的情况下温和调控下游信号传导途径，使得既不显著改变gdnf的神经保护和修复功能，又能在更长的时期内发挥作用而不引发不利的代偿效应。不受理论约束，据信其原理在于本发明选择的氨基酸突变位点并没有在gdnf与其gfrα1受体的结合界面上，因而不影响其结合以及下游的ret磷酸化，但是本发明的突变通过改变gdnf同二聚体的结构而使得部分掩盖了gdnf-gfrα1-ret复合物中磷酸化的ret的下游信号传导结构域，导致其下游信号传导速度变得适当温和，以在不显著改变gdnf的神经保护和修复功能的情况下能够在更长的时期内发挥作用而不引发不利的代偿效应。

技术特征：

1.一种人gdnf变体，其中所述人gdnf变体的氨基酸序列相较于成熟人野生型gdnf的氨基酸序列包含以下氨基酸突变：l48a、i82v、k96p、a100p、l111a和h126r。

2.根据权利要求1所述的人gdnf变体，其包含seq id no：2的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的人gdnf变体，其与成熟人野生型gdnf相比更慢地且以更低的水平刺激ret信号传导。

4.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1-3中任一项所述的人gdnf变体的核苷酸序列。

5.一种病毒载体，其包含与根据权利要求4所述的多核苷酸。

6.根据权利要求5所述的病毒载体，其选自重组痘苗病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺相关病毒、重组杆状病毒、重组乳头瘤病毒、重组慢病毒或重组禽痘病毒。

7.一种细胞，其包含根据权利要求4所述的多核苷酸或根据权利要求5或6所述的病毒载体。

8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的人gdnf变体、根据权利要求4所述的多核苷酸、根据权利要求5或6所述的病毒载体或根据权利要求7所述的细胞，以及一种或多种药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于长期给药以治疗帕金森病。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的人gdnf变体、根据权利要求4所述的多核苷酸、根据权利要求5或6所述的病毒、根据权利要求7所述的细胞或根据权利要求8或9所述的药物组合物在制备用于长期给药以治疗帕金森病的药物中的用途。

技术总结
本发明涉及一种人GDNF变体，其中所述人GDNF变体的氨基酸序列相较于成熟人野生型GDNF的氨基酸序列包含以下氨基酸突变：L48A、I82V、K96P、A100P、L111A和H126R。所述人GDNF变体与野生型GDNF相比具有相似的神经保护和修复功能，但在长期施用后引发较低的代偿作用，因而更适合进行长期给药。

技术研发人员：袁超,司文霞,喻昕,廖生洁
受保护的技术使用者：肇庆医学高等专科学校
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14