一种miRNA及其在水稻杀虫改良中的应用

本发明属于植物基因工程。具体涉及一种mirna及其水稻杀虫改良中的应用。通过克隆得到一条二化螟mirna序列，对该序列的功能验证，进而证明该mirna序列可用于水稻杀虫改良中。

背景技术：

1、植物介导的rna沉默是一种转录后双链rna(dsrna)介导的基因沉默机制，被证明是一种有效的、环保的防控害虫的替代方法。microrna(mirna)是一类长约21～28nt的非编码rna，它能触发相应的rna干扰(rnai)通路来参与生物的发育、生殖和凋亡等各种生理过程。利用天然的植物mirna前体作为骨架，把人工设计的针对目标基因的21nt的序列替换相应的天然mirna序列，依循天然mirna的生物学形成机制可生成成熟的人工mirna(artificial microrna,amirna)。然后amirna可以和天然mirna一样特异性地沉默目标基因的表达。

2、目前，在拟南芥、烟草、番茄、水稻、苔藓以及藻类等多种植物中均已成功应用amirna技术特异性地抑制内源或外源基因的表达(niu et al.2006；schwabet al.2006；quet al.2007；khraiwesh et al.2008；warthmann et al.2008；molnar et al.2009)。amirna干涉与dsrna 干涉相比具有更高的特异性，不易引起“脱靶”的现象，被誉为“第二代”基因沉默技术(tang et al.2007)。目前该技术广泛运用在功能基因组研究、品种改良和医疗领域。

3、现有技术cn 107663522 b涉及一种利用二化螟小rna培育抗虫水稻的方法。对所获得的二化螟[chilo suppressalis(walker)内源小rna序列进行了功能验证和应用研究，利用高通量小rna测序和生物信息学分析，得到一条二化螟内源的小rna csu-53的核苷酸序列，利用csu-53的序列构建人工microrna(amirna)表达载体并转化水稻，离体茎秆接虫试验表明，转基因水稻能显著延长二化螟幼虫在稻株上的生长周期，降低虫重和蛹重。该发明分离的二化螟内源小rna可应用于水稻抗虫改良中，特别是能应用于抑制水稻害虫二化螟生长中的应用。

4、现有技术cn 104673827 a本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及二化螟[chilo suppressalis(walker)]内源小rna在水稻抗虫改良中的应用。该发明对所获得的二化螟内源小rna序列进行了功能验证和应用研究。利用高通量小rna测序和生物信息学分析的手段，得到一条二化螟内源的小rna csu-15的dna序列。

5、但以上两个专利是通过离体茎秆接虫试验表明，转基因水稻只能降低幼虫的体重，抑制二化螟幼虫的生长，具有一定的抗虫效果，但并不能杀虫。

技术实现思路

1、本发明目的之一在于提供一种mirna，其核苷酸序列如seq id no:1所示或为seqid no:1所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个碱基获得核酸序列。

2、seq id no:1：cguggcgggaagcggaugcggcc。

3、优选的，所述修饰包括在如seq id no:1所示的核苷酸的3’端进行胆固醇和/或四个硫代骨架修饰全链甲氧基修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰。

4、本发明目的之二在于提供一种包括上述mirna的试剂盒、重组载体或转基因细胞。

5、本发明目的之三在于提供所述的mirna或所述试剂盒、重组载体或转基因细胞在昆虫防治中的应用，所述应用为杀灭昆虫虫体。

6、优选的，所述昆虫为水稻害虫。

7、进一步优选的，所述水稻害虫为二化螟。

8、本发明目的之四在于提供所述的mirna或所述试剂盒、重组载体或转基因细胞在制备杀虫剂中的应用。

9、本发明目的之五在于提供一种杀虫剂，所述杀虫剂中含有所述的mirna或所述试剂盒、重组载体或转基因细胞。

10、本发明目的之六在于提供一种昆虫防治方法，其包括如下步骤：使植物体表达所述的mirna。

11、优选的，所述植物体为水稻。

12、优选的，所述昆虫防治方法，包括如下步骤：

13、s1、利用所述mirna体外构建介导基因沉默的mirna表达盒；将构建好的终表达载体通过农杆菌介导的转化将其转化到水稻中，获得转基因水稻植株。

14、s2、将上述所获得的转基因水稻植株的新鲜茎秆切成茎段，饲喂给刚孵出的1龄幼虫，置于培养皿中，直至死亡，记录死亡率及个体发育情况；

15、或者取数头1龄幼虫接到转基因水稻植株上，置于养虫笼中，直至死亡，记录死亡率及植株损伤情况。

16、优选的，数头为10-30头。

17、mirnas主要通过转录调控、转录抑制、翻译抑制三个方式在后转录水平参与生物的个体发育、细胞分化、细胞凋亡和增殖等生命过程。由于mirna在昆虫发育中的重要作用，它们的表达抑制和过表达也许都会影响生物的正常发育。因mirna大小的限制，mirna的直接敲除并不能很好的实现。一般mirna功能的研究主要通过增强或减弱目的mirna的表达来鉴定。现在运用最多的就是利用特定的mirnas序列，化学合成mirna拮抗剂(mirnaantagomir)和mirna激动剂(mirna agomir)，与普通的mirna抑制剂(mirna inhibitor)和mirna模拟物(mirna minics)相比，具有更强的细胞亲和力、稳定性和抑制性。通过将mirna导入生物体内，增强或减弱目的基因的在生物体内的表达，从而影响生物体正常的生长发育过程。尤其是那些防治害虫靶标基因针对性强，且沉默后对水稻害虫有致死性，这些基因可作为理想的候选基因资源，用于创制rnai介导的新型杀虫作物。

18、本发明设计合成的mirna，即mir-1579，具有调控二化螟生殖和发育的功能，对二化螟有致死性，为二化螟的防控提供了一种有效的产品；制备的rnai介导的新型抗虫作物，绿色环保，能精确靶向靶基因来调控昆虫的生理过程，潜在的风险较小。为作物尤其是水稻害虫的防控提供了新的研究思路，具有很高的研究价值和广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种mirna，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no:1所示或为seq id no:1所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个碱基获得核酸序列。

2.一种包括如权利要求1所述的mirna的试剂盒、重组载体或转基因细胞。

3.根据权利要求1所述的mirna或根据权利要求2所述的试剂盒、重组载体或转基因细胞在昆虫防治中的应用，其特征在于，所述应用为杀灭昆虫虫体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述昆虫为水稻害虫。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水稻害虫为二化螟。

6.根据权利要求1所述的mirna或根据权利要求2所述的试剂盒、重组载体或转基因细胞在制备杀虫剂中的应用。

7.一种杀虫剂，所述杀虫剂中含有根据权利要求1所述的mirna或根据权利要求2所述的试剂盒、重组载体或转基因细胞。

8.一种昆虫防治方法，其特征在于，包括如下步骤：使植物体表达如权利要求1所述的mirna。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物体为水稻。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种miRNA及其在水稻杀虫改良中的应用。所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或为SEQ ID NO:1所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个碱基获得核酸序列。本发明设计合成的miRNA，即miR‑1579，具有调控二化螟生殖和发育的功能，对二化螟有致死性，为二化螟的防控提供了一种有效的产品；制备的RNAi介导的新型抗虫作物，绿色环保，能精确靶向靶基因来调控昆虫的生理过程，潜在的风险较小。本发明设计合成的miRNA为作物尤其是水稻害虫的防控提供了新的研究思路，具有很高的研究价值和广阔的应用前景。

技术研发人员：李有志,唐彦,邱林,丁文兵
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13